[論文關鍵詞] 熒光PCR定量技術；基因定位技術；遺傳病
[論文摘要] 熒光PCR定量技術(Quantitative PCR)是一種新興的基因定位技術。這項技術靈敏、簡便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成後，通過測序儀的自動識別即可對待測DNA進行定量分析。在遺傳病，特別是一些以大片段缺失為主要突變型別的遺傳病診斷中，熒光PCR定量技術發揮了很重要的作用。
在早期的遺傳學分子診斷中，主要依賴於Southern Blotting，寡核苷酸雜交等技術。自1985年Saiki等首次描述聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術因為其靈敏特異，省時省力等諸多優點而受到了人們的高度重視，已經應用於生物和化學等基礎研究的各個領域，並且成為醫學和法醫學研究的強有力分析工具之一[1-3]。然而，近幾年來，研究者們不再滿足於得知某一特異DNA序列的存在與否，他們更著眼於對其進行精確的核酸定量。儘管把PCR作為一種定量的工具，在技術上還面臨著一些挑戰。熒光PCR基因定位技術是近十餘年來興起的一種分子生物學技術，與其他定量方法相比，具有靈敏、簡便、快速、不需使用放射性同
位素的特點，在基因表達、傳染病和遺傳病的診斷等方面迅速得到了廣泛應用。
1 熒光PCR基因定位技術的原理
熒光PCR定量技術的主要原理為：在PCR前，通過化學方法在引物的5’端通過共價方式連線一個熒光分子。由於在進行PCR時，引物和待擴增模板5’端的鹼基不需要完全匹配，熒光PCR引物和普通PCR引物一樣，能夠對待測模板進行指數擴增。擴增完成後，根據PCR的產量，將熒光PCR產物直接或按一定比例稀釋後，和內標、載樣緩衝液混合，在自動測序儀上進行電泳。在自動測序儀內鐳射的激發下，PCR產物上的熒光分子發出固定波長的激發光，被儀器內的光電管捕獲。根據PCR產物從開始電泳到經過光電管的時間，測序儀自動計算出相應產物的實際鹼基數。不同泳道之間電泳速度的.差別，通過各產物內混合的內標校正。同時，測序儀也自動標出相應產物的熒光強度，該數值就是熒光PCR定量技術對模板進行定量與定位的基礎。與非定量PCR分析方法不同，熒光PCR的操作程式有助於評估汙染的情況，即測出汙染的程度，即使陰性對照產生了正的訊號，只要這些訊號比實驗樣品的低得多，依據這樣的結果，至少可以推測出實驗中所得出的訊號是真實的[4-6]。在一定程度上，熒光PCR消除了普通PCR過於敏感、假陽性率高的缺點。熒光PCR常用於研究發病機制、估計病毒的負荷量、監測臨床治療進展或用於診斷遺傳缺陷等。通過對靶基因量的檢測，將其與疾病的臨床表現、臨床分型以及各種標誌酶的值聯絡起來，為疾病的診斷和物治療監測提供科學的依據。目前，該技術已廣泛應用於多種遺傳病的診斷和產前篩查，如地中海貧血、兒童型脊肌萎縮症、杜氏/貝氏肌營養不良、胖骨肌萎縮症和各種染色體病等。
2 熒光PCR基因定位技術在遺傳病診斷中的應用
2.1 在α地中海貧血中的診斷作用
1988年，Chehab用兩對引物同時擴增α珠蛋白和β珠蛋白基因，並在這兩對引物上分別標記上羅丹明和熒光素。在紫外線的照射下，羅丹明產生紅色熒光而熒光素產生綠色熒光。在同一迴圈條件下PCR完成後，通過離心將擴增產物和遊離引物分離，根據擴增後產物顏色直接判斷基因的缺失情況[7]。如產物為桔紅色，則說明α和β珠蛋白基因都得了擴增。如果產物為綠色，說明α珠蛋白基因缺失，只有顯綠色熒光的β珠蛋白基因得到了擴增。