1 引言
柑桔潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種( Xanthomonas axonopodis pv. citri) 引起的一種國內外重大檢疫性病害，給世界柑桔產業帶來了巨大經濟損失。病菌主要隨罹病種苗等繁殖材料遠距離傳播，生產上常用的銅基殺菌劑和抗生素製劑對其防效不佳[1]，探索柑桔潰瘍病的防治新途徑在目前和將來都具有重大意義。基因工程重組單抗兼具治療和診斷雙重功能，利用抗原-抗體特異性結合原理，可用於人類疾病、植物病害的診斷、治療和預防。
近年來發展起來的噬菌體抗體庫技術使人們可以繞開細胞雜交瘤技術，直接從基因水平製備特異性單鏈抗體，由此開創了簡便、快速生產基因工程抗體的先河，被認為是繼雜交瘤技術後抗體生產技術的又一次革命[2,3]。20 世紀80 年代中期，Smith[4] 等提出了噬菌體展示技術，到90 年代初，Winter 等在前人的研究基礎上建立了噬菌體抗體庫技術，將噬菌體展示技術應用到抗體工程領域，徹底改變了製備抗體的傳統途徑，使抗體技術進入到了基因工程抗體時代。近年來噬菌體抗體庫技術已經成功應用於醫學研究及疾病診斷方面，但應用在植物病害方面研究的報道卻寥寥無幾[5,6]。Fab 抗體是由抗體輕鏈片段及重鏈的Fd 段組成的，與單鏈抗體ScFv 相比，具有穩定性更好的特點，且可直接在大腸桿菌中表達有活性的抗體，製備簡單，省去了復性等繁瑣的步驟。本研究採用噬菌體抗體庫技術，以經過多次免疫的小鼠脾細胞mRNA 為基礎，擴增出抗體輕鏈及重鏈Fd 段分別連線到噬粒載體中構建噬菌體抗體庫，為後面的研究奠定基礎。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 實驗動物
6～8 周齡BALB/c 小鼠4 只，均購自第三軍醫大。
2.1.2 菌株及載體
噬粒 pComb3XSS 由美國Barbas 實驗室饋贈；Top10 F’、輔助噬菌體VCSM13 為本中心儲存；大腸桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue 由重慶工學院饋贈。
2.1.3 試劑及耗材
TRIZOL 購自Invitrogen 公司；M-MLV 反轉錄酶購自Promega 公司；限制性內切酶SacⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 連線酶均購自NEB 公司；其它試劑為國產分析純。
2.1.4 引物
參照美國 Scipps 研究所鼠源抗體庫構建的引物及《實用分子生物學操作指南》[7]設計簡併引物，由上海生工合成。
2.2 方法
2.2.1 動物免疫
將柑桔潰瘍菌用生理鹽水稀釋至 1×108CFU/ml，取0.5 ml 腹腔注射6～8 周齡BALB/c小鼠，每週免疫一次，免疫4 周後用ELISA 法測血清效價，加強免疫3 天后取脾，並用無菌注射器針柄在200 目的不鏽鋼濾網中將脾臟分離成單個細胞，加入Eppendorf 中，離心去上清，用液氮速凍後70℃儲存。
2.2.2 提取RNA 及cDNA 第一鏈擴增
按照 Trizol 試劑盒說明書提取小鼠脾臟RNA，通過凝膠電泳及測OD 值確定RNA 的質量。以Oligo-dT 為引物反轉錄合成cDNA 第一鏈。
2.2.3 PCR 擴增輕鏈及重鏈Fd 段基因
通過溫度梯度摸索 PCR 反應條件為94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 10min，35 個迴圈，PCR產物在1.5 %瓊脂糖凝膠電泳驗證, 採用凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR 產物。
2.2.4 鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab 抗體庫的構建
將 κ 鏈基因 PCR 產物與 pComb3xss 分別用 SacⅠ/XbaⅠ消化，經瓊脂糖電泳分離並純化回收, 取1.0 μg 載體片段與0.2 μg κ 鏈片段在80 μL T4 DNA 連線酶反應體系中進行連線反應, 經沉澱回收後電擊轉化XL1- Blue 感受態細菌, 加入2 mL SOC，37℃、250rpm 培養1 h 後取少量鋪盤測定, 其餘加入100 mL 含50 μg /mL 氨苄青黴素和10 μg/mL 四環素的 SB 培養液中培養過夜。提取質粒, 得到輕鏈庫。再分別將輕鏈庫與Fd 段用 SpeⅠ/XhoⅠ酶切後回收，按前法進行連線、轉化、細菌擴增及轉化子測定。在加入100mL SB 培養液1 h 後加入1 mL 約1012 pfu 的輔助噬菌體 VCSM 13，再培養2 h 後，加卡那黴素至70 μg/mL，37 ℃振盪過夜。次日離心收集上清, 加 PEG8000 至4%、NaCl 至3%,冰浴30min，4℃、9 000 r /min 離心20 min, 棄上清, 用2 mL 1%的BSA- PBS 溶解沉澱, 12000 r /min 離心5 min, 棄去不溶性沉澱, 所得上清即為 Fab 噬菌體抗體庫。