銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因為可以消除O- ・2而被廣泛應用於延緩衰老和控制炎症，但是由於多種因素影響，尤其是Cu，Zn-SOD具有種質特異性以及在體內停留時間短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的應用受到很大限制。定點突變技術是改造、優化基因常用的手段，也是研究蛋白質結構和功能之間複雜關係的.有效方法，在醫學上還可用於基因治療等。目前常用的定點突變方法有寡核苷酸引物介導的定點突變、重疊延伸PCR定點突變及盒式突變等〔1〕。但由於這些方法操作繁瑣，意外突變多等缺陷，使定點突變的實驗受到一定限制。本研究採用一種近年來新的定點突變技術―快速PCR定點突變方法成功地對hCu，Zn-SOD進行了基因改良(將hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密碼子突變為Ala密碼子，以提高其穩定性)，同時對該定點突變技術要點進行探討。
1 材料
11 菌株與質粒 DH5α，由本實驗室儲存。質粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位點，整個質粒約33kb)由本實驗室構建，並轉化於 DH5α儲存。
12 主要試劑 Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南華美生物工程有限公司);小量質粒快速抽提純化試劑盒(上海博亞生物技術有限公司);DNA Marker,T4DNA連線酶，Eco RI等常規酶(上海Sangon公司)。
13 pESOD質粒提取及鑑定 用質粒快速抽提純化試劑盒從含pESOD質粒的 DH5α轉化菌裡提取pESOD質粒，取部分質粒用EcoRI酶切後瓊脂糖電泳鑑定，另取部分質粒送上海博亞生物技術有限公司測序。
14 定點突變
141 引物設計 根據hCu，Zn-SOD基因序列和定點突變的要求(將hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密碼子TGC突變為Ala密碼子GCC)設計出一對包含突變位點的引物(正、反向)P1和P2,具體序列如下：P1：5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3′；P2：5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3′。下劃線的鹼基為突變位置。所有引物均由上海博亞生物技術有限公司合成。
142 PCR定點突變 整個反應體系為50μl，其中含無菌去離子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、P2引物各1μl，pESOD質粒1μl(約100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反應條件為：94℃預變性3min；然後94℃變性1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25個迴圈；最後72℃延伸7min，4℃儲存。
143 轉化 用Dpn I限制性內切酶處理PCR反應產物，直接轉化感受態的 DH5α，塗布培養後隨機挑3個菌落並提取相應質粒，由上海博亞生物技術育限公司測序，測序引物P3：5′ACTCAGGTACTGGGAGTG 3′。
2 結果
21 提取的質粒經EcoRI酶切後瓊脂糖電泳 質粒大小為3300bp左右，證明所提取的質粒就是pESOD質粒，見圖1。
1：EcoRI酶切後的pESOD質粒;2：Marker
圖1 pESOD質粒經EeoRI酶切後瓊脂糖電泳（略）
22 PESOD質粒測序的部分結果 所測序列與文獻