隨著全球人口的急劇老齡化, 神經退變性疾病已成為一個嚴重的問題, 其中阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 已經成為人類晚年精神衰竭的最普遍的形式。AD 是一種神經退變性疾病, 臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化, 日常生活能力進行性減退, 並有各種神經精神症狀和行為障礙。儘管其發病機制還沒有完全闡明, 但研究表明, AD 患者腦中低的乙醯膽鹼水平、β-澱粉樣蛋白 (β-amyloid, Aβ) 的異常增加與沉積以及氧化損傷等在AD 的發病機制中起著重要的作用。
目前AD 主要具有3 種特徵性的病理表現: 神經傳遞基質乙醯膽鹼水平的降低、患者大腦小半鞘翅中β-澱粉樣蛋白增加[和Tau 蛋白 (含量最高的微管相關蛋白) 的過度磷酸。人們還在為探索AD 的病因做著更多、更新的研究。目前治療AD 以乙醯膽鹼酯酶抑制劑 (AChEI) 為主, 如利斯的明 (rivastigmine)、他克林 (tacrine)、多奈哌齊 (donepezil)、加蘭他敏 (galanthamine) 和石杉鹼甲 (huperzine-A)等。但是已經開發的這些藥物無法完全滿足臨床的需求, 需要進一步開發高效低毒的藥物來滿足社會的需要。
近來報道了1 個新化合物Ⅰ及其類似物, 對抑制AChE 有非常好的效果, 其IC50 值達到了0.51 μmol·L1。有文獻報道化合物含有富電子 (如甲氧基) 的芳香基團, 能夠與AChE 的外周陰離子結合部位 (peripheral anionic site, PAS) 結合。化合物Ⅰ的A 官能團擁有甲氧基、苯環和噻唑環, 都有很豐富的電子, 使它能很好地結合PAS位點, 因而擁有極好的活性。本文依據生物電子等排原理, 用A1 官能團代替A 官能團, A1 官能團由苯環和咪唑酮環組成,電子同樣富有, 而且A1 官能團的電子更為集中, 預想它能與PAS 部位更易結合且更穩固; 在對先導物化合物進行合理生物電子等排取代時, 用苯環代替噻唑環, 咪唑酮代替苯環, 使其引數 (鍵角、雜化、電子分佈、電荷等) 儘可能的保留, 進一步稠合成苯並咪唑酮結構。
本文研究治療AD 的出發點是從抑制乙醯膽鹼酯酶著手。隨著乙醯膽鹼酯酶晶體結構的研究, 發現人的 的活性部位是一個由表面向內部伸展的狹長通道, 呈啞鈴型, 通道開口處和底部比較開闊,中間狹窄。開口處富含帶負電荷的氨基酸殘基如酪氨酸、色氨酸和天冬氨酸等, 該位置被稱為外周陰離子結合部位, 底部是AChE 的催化活性中心 (catalysisactive site, CAS)。研究發現, AD 患者腦中高活性AChE 多聚集在神經斑塊和神經纖維結處, 而且AChE 的PAS 部位能促進Aβ 蛋白的形成並加速其沉澱。這些研究表明, AChE 可能在AD 發展過程中起著多重作用, 因此同時作用於AChE 的CAS 部位和PAS 部位的雙位點抑制劑可能對AD 治療有多重作用機制。因此本文對化合物Ⅰ另一部分修飾就是延長或縮短碳鏈, 尋找能同時作用於AChE 的CAS 部位和PAS 部位的雙位點抑制劑, 也就是B1 官能團代替B。最終合成新的化合物Ⅱ並考察它們對AChE的抑制作用, 為新的AChEI 的開發做探索性研究。本文以5-氨基苯並咪唑酮為原料, 經過醯胺化反應, 生成化合物1～4, 化合物1～4 與二級胺反應生成目標化合物。
結果與討論
1 目標化合物的合成
目標化合物的結構經1H NMR、MS、元素分析及IR 得以確證, 理化資料。
2 乙醯膽鹼酯酶體外抑制活性
為了進一步研究化合物的生物活性, 進行了AChE 體外抑制活性實驗。測試結果表明, 製備的19個化合物中, 5 個具有生物活性 (表3)。化合物4d 對乙醯膽鹼酯酶的抑制活性是最佳的, 其IC50 平均值達到了7.2 μmol·L1, 優於對照藥利斯的明, 但沒有石杉鹼甲的活性好。通過化合物的結構對比發現, 5 個有活性的化合物有3 個醯基上的碳鏈為4 個亞甲基,並且活性最好的4d 也含有4 個亞甲基, 由此推測碳鏈比較長時, 活性較好。二級胺對化合物的活性也有顯著的影響, 從化合物1a～4d 之間可以得出, 不同的含氮基團對化合物的活性有決定性的作用, 當R3是CH3N(CH2CH2)2N-時, 化合物才表現出最好活性。
3 丁醯膽鹼酯酶體外抑制活性
膽鹼酯酶是體內迅速水解乙醯膽鹼的酶, 表面有兩個活性中心, 既CAS 部位和PAS 部位。該酶有兩種: 真性膽鹼酯酶 (乙醯膽鹼酯酶), 存在於膽鹼能神經元內、膽鹼能突觸及紅血球內, 是水解內源性乙醯膽鹼的必需酶; 假性膽鹼酯酶 (丁醯膽鹼酯酶),主要存在於血漿、肝臟及膠質細胞, 在終止內源性乙醯膽鹼的作用上不起主要作用, 並且抑制BuChE, 會引起幹細胞損傷。因此有必要對BuChE 的活性進行測定。選擇對乙醯膽鹼酯酶抑制活性的化合物做了相應的丁醯膽鹼酯酶體外抑制活性實驗, 並與對照藥進行了比對, 5 個化合物中只有4d 對丁醯膽鹼酯酶有抑制活性 (表4), 但對於丁醯膽鹼酯酶抑制效果不佳, 因此選擇性相對較好。
4 小結
合成的19 個化合物中化合物4d 對乙醯膽鹼酯酶的生物活性最好, 其IC50 均值達到了7.2 μmol·L1,活性優於對照藥物利斯的明但不如石杉鹼甲。其對丁醯膽鹼酯酶的抑制活性均值為1 200 μmol·L1, 說明4d 對乙醯膽鹼酯酶抑制有很好的選擇性。因此5-氨基苯並咪唑酮類衍生物對乙醯膽鹼酯酶的活性值得進一步的研究。
實驗部分
所有實驗材料除另作說明外, 均為市售。乙醯膽鹼 (電鰻) 購自Sigma 公司。用SGW X-4 顯微熔點儀測定熔點 (上海精密科學儀器有限公司, 中國),溫度未校正。1H NMR 由Bruker AVANCE 600 核磁共振儀 (DMSO-d6 為溶劑, TMS 做內標) 測定。質譜由Bruker apex ultra 7.0 T 傅立葉變換型質譜儀測定; 元素分析由Carlo Erba-1160 型元素分析儀測定; 紅外光譜採用FTIR-8400S 傅立葉變換紅外分光光度計。96 孔板讀取用1420 Victor 酶標儀。
1 化合物合成
1.1 化合物1～4 的合成 (以化合物1 為例)
取0.1mol (14.9 g) 的5-氨基苯並咪唑酮、0.05 mol K2CO3(6.9 g) 和200 mL 的N, N-二甲基甲醯胺 (DMF) 置於500 mL 的反應瓶中, 室溫攪拌, 然後滴加氯乙醯氯和DMF 的混合溶液, 混合溶液用等體積的氯乙醯氯 (0.11 mol) 和DMF 混合, 然後搖勻, 滴加完後反應10 min。反應結束後加入600 mL 水, 出現沉澱,靜置半小時抽濾, 每次用50 mL 的水沖洗3 遍, 晾乾稱重得到9.5 g 淺灰色化合物1, 收率69%, 熔點303～305 ℃。1H NMR δ 10.57 (s, 1H, imidazole-H),10.52 (s, 1H, imidazole-H), 10.16 (s, 1H, -CONH-),7.44 (d, J = 1.7 Hz, 1H, ArH)), 7.01 (d, J = 1.9 Hz, 1H,ArH)), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH)), 4.21 (s, 2H,-CH2-); ESI-MS m/z 226.0 [M+H]+; C9H8N3O2(EA)Calcd. (%): C 48.00; H 3.56; N 18.67; Found (%): C47.91; H 3.57; N 18.62。同法制的化合物2～4。化合物2: 收率: 70%, 熔點299～301 ℃。1 H NMR δ 10.56 (s, 1H, imidazole-H),10.49 (s, 1H, imidazole-H), 9.92 (s, 1H, -CONH-), 7.47(s, 1H, ArH), 7.01 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 6.84 (d,J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 3.87 (t, J = 6.0 Hz, 2H, -CH2-),2.79 (t, J = 6.0 Hz, 2H, -CH2-); ESI-MS m/z 240.1[M+H]+; C10H10N3O2(EA) Calcd. (%): C 50.21; H 4.18;N 17.57; Found (%): C 50.12; H 4.21; N 17.53。化合物3 收率65%, 熔點290～292 ℃。1H NMRδ 10.53 (s, 1H, imidazole-H), 10.46 (s, 1H, imidazole-H), 9.85 (s, 1H, -CONH-), 7.46 (s, 1H, ArH), 7.05～7.00 (m, 1H, ArH), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH), 3.68(t, J = 6.5 Hz, 2H, -CH2-), 2.45 (t, J = 7.3 Hz, 2H,-CH2-), 2.06～1.99 (m, 2H, -CH2-); ESI-MS m/z 254.1[M+H]+; C11H12N3O2(EA) Calcd. (%): C 52.17; H 4.74;N 16.60; Found (%): C 52.08; H 4.77; N 16.56。化合物4 收率64%, 熔點298～299 ℃。1H NMRδ 10.52 (s, 1H, imidazole-H), 10.45 (s, 1H, imidazole-H), 9.74 (s, 1H, -CONH-), 7.46 (s, 1H, ArH), 7.00 (d,J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH),3.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H, -CH2-), 2.31 (t, J = 7.0 Hz, 2H,-CH2-), 1.76 (dd, J = 13.5, 6.8 Hz, 2H, -CH2-), 1.71 (dd,J = 14.3, 7.1 Hz, 2H, -CH2-); ESI-MS m/z 268.1[M+H]+; C12H14N3O2(EA) Calcd. (%): C 53.93; H 5.24;N 15.73; Found (%): C 53.84; H 5.27; N 15.70。
1.2 化合物1a～2e 的合成 (以化合物1a 為例)
取0.5 g 化合物1 (2.2 mmol)、0.9 g 三乙胺 (8.8 mmol)、0.2 g 四氫吡咯 (2.5 mmol) 和3 mL DMF 置於反應試管中, 80 ℃反應8 h。反應結束後加入9 mL 水, 出沉澱, 靜置12 h 後抽濾, 用5 mL 的水沖洗, 沖洗3遍, 確保DMF 除淨, 晾乾稱重得到0.1 g 化合物1a,同法制的化合物1b～1f、2a～2e。
1.3 化合物3a～4d 的合成 (以化合物3a 為例)
取0.5 g 化合物3 (2 mmol)、0.8 g 三乙胺 (8 mmol)、0.16g 四氫吡咯 (2.2 mmol) 和3 mL DMF 置於反應試管中, 120 ℃反應8 h。反應結束後加入20 mL 二氯甲烷,出沉澱, 靜止1 h 後抽濾, 每次用5 mL 的二氯甲烷沖洗, 沖洗3 遍, 除掉DMF, 然後用300 mL 甲醇溶解所得固體。減壓蒸出溶劑, 剩餘物經矽膠色譜柱 (洗脫劑為二氯甲烷與甲醇, 體積比6∶1) 分離純化得到0.15 g 3a, 同法制的化合物3b～3d、4a～4d。
2 體外AChE 抑制實驗
採用Ellman 分光光度法[20]在體外考察化合物對電鰻乙醯膽鹼酶的抑制作用,設定空白組, 利斯的明、石杉鹼甲為陽性對照組進行實驗。配製Tris 緩衝液pH 為7.2, 底物ACTI (碘化硫代乙醯膽鹼) 的濃度為0.6 mmol·L1, 顯色劑DTNB 的濃度為3 mmol·L1,電鰻AChE 總量為0.035 U, 抑制劑的配置濃度分別為1×104、1×105、1×106、1×107、1×108 mol·L1。分別取20 μL Tris 緩衝液、10 μL 電鰻AChE、10μL 各濃度的抑制劑於96 孔板中, 37 ℃下保溫12 min,然後加入10 μL 底物ACTI 和50 μL 的顯色劑DTNB,5 min 後使用1420 Victor 多標計數儀在405 nm 處讀取每孔吸光度。空白組用10 μL Tris 緩衝液分別代替底物和抑制劑, 標準組用10 μL Tris 緩衝液代替抑制劑, 每個化合物在不同濃度均實驗2 次。然後以抑制率I [I = 100 × (A 測A 空) / (A 標A 空)%] 對抑制劑濃度C 作圖, 進行S 型曲線線性擬合, 得到半數抑制率IC50 對應的濃度Cx, 為了得到準確的IC50, 然後從1×105～1×109 mol·L1 中選擇最接近Cx 的濃度1×10x mol·L1, 且1×10x mol·L1 小於Cx。配製1×10x、3×10x、5×10x、7×10x、9×10x mol·L1, 同法操作酶抑制實驗, 然後以抑制率I 對抑制劑濃度C作圖, 進行直線線性擬合, 求出IC50。
3 體外BuChE 抑制實驗
取5 mL 靜脈人血, 室溫靜置1 h, 4 ℃放置2 h。用離心機2 000 r·min1 離心10 min, 取上清液, 即得丁醯膽鹼酯酶酶液。其實驗具體操作方法與乙醯膽鹼酯酶酶活力測定方法相同, 將乙醯膽鹼酯酶酶活力測定中的底物碘化硫代乙醯膽鹼換成碘化硫代丁醯膽鹼即可。