1.引言
精神分裂症在人群中大約有1%的發病率，表現為錯覺，幻覺，認知改變，情緒激動和行為異常。在已知各種致病因素中，遺傳因素大約佔據了80%的作用，表現為多個微效基因共同作用的結果。
許多研究都證明了染色體12q22-34 與精神分裂症之間的連鎖關係。近年來，位於染色體13q33 的兩個重疊基因：DAOA (D 型-氨基酸氧化酶啟用劑) 和 G30, 被報道與精神分裂症顯著性相關。在此後的獨立的研究中，也報道了這種關聯。然而，也有幾項研究沒能重複出這種結果。此外，還有其他幾項研究表明，在這一區域可能存在不止一個易感位點。
基因Ephrin-B2 (EFNB2)位於DAOA 基因下游1Mb 處，在染色體13q33 上佔據約45kb的區域。它編碼酪氨酸激酶家族成員的一個蛋白質成員(ephrin)，參與調節生長髮育，尤其是神經系統的發育。因此，根據其位置和功能特點，EFNB2 基因很可能是這個區域內精神分裂症的一個新的易感基因。
為了進一步研究EFNB2 基因座位在精神分裂症中的易感性，我們使用中國漢族人的病例-對照樣本，在該基因所在區域選取了幾個SNPs，進行遺傳標記的單位點，多位點和單倍型的遺傳分析。
2.材料和方法
2.1 研究物件
此研究得到地方精神病研究道德倫理委員會的支援並且得到所有研究物件的同意。
此項研究共包括846 份樣本，其中477 例精神病患者(273 例男性，平均年齡為42.3?9.8歲，平均發病年齡為24.6?16.3 歲；204 例女性，平均年齡為46.0?12.6 歲，平均發病年齡為27.0?8.3 歲)和369 例正常對照(215 例男性，平均年齡為29.4?14.4 歲；163 例女性，平均年齡為29.6?14.2 歲)。由西安交通大學第一附屬醫院根據精神分裂症的Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV)標準，結合患者病例記錄及臨床問診，對所有的患者進行診斷。兩位資深的精神分裂症醫師分別獨立地對患者資料進行復核。正常對照者來自當地誌願者以及自願獻血者。全部對照者均無神經或精神方面疾病，以及家族患病史。
所有的研究物件都是漢族血統。中國醫學論文網專業提供醫學論文發表服務，並提供大量醫學畢業論文，如有業務需求請諮詢網站客服人員！
2.2 基因分型
我們在 Hapmap 資料庫中選擇EFNB2 基因區域的三個tagSNPs(rs9520087, rs11069646 和rs8000078)，又在NCBI 資料庫中選取了rs1046775，這是在EFNB2 座位上導致組氨酸到酪氨酸的唯一一個錯義突變。如圖1 所示。
然而，當對這些位點進行基因分型時，我們發現rs1046755 並不具有多型性，因此該位點被排除在研究之外。最終，剩下的三個位點的跨度大約為45kb 的區域，平均間隔約為22.5kb。
我們使用等位基因特異性PCR 的方法進行基因分型，這種方法在其他研究中已有報道。PCR 引物由tetra-primer ARMS-PCR 引物設計程式設計。引物序列。
為了確定所獲的基因型的正確性，我們隨機選了80 個DNA 樣本對這三個SNPs 再次進行基因分型。所有的基因型都與第一次的基因分型結果一致，未發現基因分型錯誤。
2.3 資料分析
使用 Hwsim 軟體程式對三個SNPs 進行哈迪-溫伯格平衡檢驗。對於病例-對照組，運用Epi_Info 軟體程式對遺傳標記的等位基因分佈進行卡方檢驗。使用2LD 軟體程式計算出D’值，以衡量兩兩SNPs 之間的連鎖不平衡程度，從而構建單倍型。使用PHASE 程式的2.2版本模擬各種單倍型頻率。Bonferroni 校正被用於進行各項統計結果的校正。使用G*Power程式進行統計效力計算，當設定引數為0.2 時（代表基因作用“微效”），當前使用的樣本數量對於關聯研究而言，具有89%的統計效力。
3.結果
在兩組樣本中，這三個SNPs 位點都具有高度的多型性。其中兩個SNP (rs11069646 和rs8000078)在病例和對照中的基因型分佈均符合哈迪-溫伯格平衡 (P>0.05)。對於rs9520087，在對照組(P=0.018)和病例組(P=5.2x10-22)中均發現對哈迪-溫伯格平衡的背離。
在 477 例中國漢族人的精神分裂症患者樣本中，位於基因EFNB2 區域的3 個SNPs 的等位基因的頻率，以及相對應的369 例正常對照樣本的等位基因頻率如表2 所示。對於遺傳標記rs9520087，在病例和對照組的樣本之間(X2=8.11, P=0.0044)以及兩組女性之間(X2=6.97,P=0.0083)存在及其顯著性差異。經過多重檢驗校正後，這種顯著性差異仍然存在(分別為P=0.013 和P=0.025)。
近來，Zou 等人發現1）哈迪-溫伯格平衡檢驗不能用來鑑定基因分型的錯誤；2）在檢驗等位基因與疾病的關聯之前進行哈迪-溫伯格平衡的驗證，是不必要的甚至是有害的。相反的，應該運用趨勢檢驗，使人們對背離哈迪-溫伯格平衡的資料進行分析[33]。有鑑於此，我們重新分析了我們的資料，結果發現遺傳標記rs9520087 與精神分裂症存在關聯(在所有樣本中XA2=6.11, P=0.0135；在女性樣本中XA2=5.11, P=0.0229)。經過Bonferroni 校正，遺傳標記rs9520087 仍然保持顯著性差異(在所有的樣本中P=0.04)。
我們在單倍型分析中，使用這三個SNPs(rs9520087, rs11069646 和rs8000078)進行構建，並且觀察到了8 種單倍型，如表4 所示。我們發現單倍型的分佈與精神分裂症相關(總體P=0.0065)。在病例組和對照組之間比較單倍型頻率時，我們發現單倍型TTC 表現出及其顯著性的差異(P=0.004)，其頻率在病例組中偏高(8.85% 比5.18%)；而單倍型CTC 也顯示出了顯著性的差異(P=0.046)，其頻率在病例組中偏低(38.17% 比42.90%)。我們進一步分析發現，單倍型TTC 在男性群體中與精神分裂症關聯(P=0.029)。對上述結果，進行嚴格的修正(8 種單倍型和3 個等位基因的比較)後，我們發現單倍型TTC 仍然保持了顯著性的差異(P=0.044)。
4.討論
我們此次研究的目的是為了檢驗EFNB2 基因座位和精神分裂症之間的關係。三個SNPs位點在染色體13q33 上大約覆蓋了45kb 的區域，其中包括EFNB2 基因，我們在中國漢族人的樣本中對這三個SNPs 位點進行基因分型。
我們的樣本中，遺傳標記rs9520087 和精神分裂症之間顯著相關，但對這個結果我們保持謹慎的態度，因為在我們的樣本中發現遺傳標記rs9520087 背離了哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)。但對於遺傳標記rs9520087 的背離，至少從三個方面看來都不是一種假陽性結果。
第一，基因型頻率的背離在病例組中極其顯著(P=5.2x10-22)，當在對照組中則非常微弱(P=0.018)。第二，該遺傳標記的等位基因頻率在病例和對照組中存在極其顯著性的差異(P=0.0044)。第三，經過對背離哈迪-溫伯格平衡的資料的趨勢校正後，遺傳標記rs9520087依然顯示了同疾病的顯著性關聯(P=0.0135)。
此外，我們還發現遺傳標記rs9520087 的等位基因頻率在對照組中為0.323。這與HapMap資料庫中報道的0.663 存在很大的不同。這種差異可能是由於各自相對較小的樣本數量引起的，即dbSNP 為84 人，我們的樣本量為369 人。當前對於此現象還不能給出很好的解釋，未來隨著更多研究報道的出現，會有更多中國漢族人的資料報道，那時再來探討二者的正誤可能更為合適。另一個方面，儘管我們在研究中沒有發現任何基因分型的錯誤，但是基因分型的.錯誤依然不能完全避免。
當然，僅僅從單個 SNP 位點分析而得到的資訊是有限的。因此，為了獲得更加有力的證據，我們又進行了單倍型分析。而單倍型分析是在遺傳標記之間，利用連鎖的有關資訊進行的。
由於這三個SNP 之間不存在連鎖不平衡(D’<0.5 和r2 <0.8)，我們將三個位點全部用來構建單倍型。結果顯示，遺傳標記rs9520087-rs11069646-rs8000078 的單倍型分佈頻率與精神分裂症之間顯示了顯著性關聯(P=0.0065)。當在病例組和對照組間對每種單倍型進行比較和分析時，我們發現單倍型TTC (P=0.004) 存在很強的顯著性差異，而單倍型CTC(P=0.046)也存在較弱的顯著性差異。我們的結果表明，單倍型TTC 很可能是精神分裂症的一個風險單倍型。另外，遺傳標記SNP rs9520087 (C to T)位於基因EFNB2 的3’-UTR 區，這表明該位點很可能參與調節EFNB2 基因的表達。而實際上，至少有兩個理由可以認為3’-UTR 區在調節基因表達方面起著重要的作用：1）3’-UTR 區參與了mRNA 的3’ 末端的形成，mRNA 的穩定性和降解，以及mRNA 的亞細胞定位。研究發現3’-UTR 區是microRNA(miRNA) 的靶標序列， 而miRNA 對基因表達的調節作用主要是通過miRNA-mRNA 3’-UTR 的相互作用實現的。
目前已知，EFNB2 基因參與調節個體的生長髮育，尤其是神經系統的發育。此外，穀氨酸能神經遞質系統的異常在精神分裂症的發展中起著特別的作用。另一方面，EFNB2基因位於染色體13q33，該區域在精神分裂症的遺傳連鎖研究中恰好是一個熱點區域。因此，無論從功能還是位置來講，EFNB2 基因都是精神分裂症的一個引人注目的候選基因。
還需要指出的是，本項研究中我們在EFNB2 基因上選擇了數個SNP 位點，而沒有選擇全部的SNP 位點。這種選擇可能使這些SNP 位點的分析結果被認為不具有代表性。此外，我們從不同性別對等位基因和單倍型頻率進行了分析，儘管結果顯示在男性和女性中存在一定的差異，但是這種統計分析尚不足以說明與性別有關的遺傳機制。
綜上所述，我們的研究為EFNB2 基因與精神分裂症之間的關聯提供了證據支援。由於精神分裂症和其他複雜性遺傳疾病在關聯研究方面的複雜模式，還需要用不同的人群樣本進行更為深入和廣泛的研究與驗證。未來關於EFNB2 基因和其他候選基因的研究將會更好的闡明NMDA 受體途徑在精神分裂症的發病機制中的作用。