發現一種提取液能促進體細胞向幹細胞轉變將在再生醫學研究中有重要的意義，下面是小編蒐集整理的一篇探究雞蛋白提取液對體外培養幹細胞蛋白影響的論文範文，歡迎閱讀參考。
有文獻報道動物的卵細胞提取液能重新程式設計體細胞，包括豬的卵細胞[1]和非洲爪蟾的卵細胞[2,3]提取液都能使體細胞核重程式設計。在這個研究中，我們用雞蛋白提取液作用於不同細胞，共培養3d後，收集細胞，送公司做幹細胞蛋白晶片檢測，現將研究報道如下。
1材料與方法
1.1細胞來源
4種細胞為我們實驗室經常培養的細胞，C57小鼠的骨髓間充質幹細胞(C57-BMSC)(自己製備),樹鼩的臍帶間充質幹細胞(TS-UC-MSC)(自己製備),293T細胞(購自中國科學院昆明細胞庫)和GFP慢病毒轉染成功的293T細胞(293T-GFP)(自己轉染成功).
1.2雞卵清提取液的製備
取幾個雞卵，無菌分離卵清和卵黃，卵清按1∶1加裂解液，充分攪勻，存放於-20℃。凍融3次後，離心，取上清，4℃儲存。裂解液配方：50mmol/LNaCl,5mmol/LMgCl2,100mmol/LHEPES,pH8.2,1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT),0.1mmol/L苯甲基磺醯氟(PMSF)和蛋白酶抑制劑。由此得到的提取液為雞卵清提取液。獲得的提取液用50%的終濃度與293T細胞共培養3d,然後用定量PCR的方法檢測細胞多能基因OCT4和NANOG與對照(培養基培養)相比明顯升高，即為質控指標合格，可用於下面的實驗。
1.3幹細胞蛋白晶片檢測步驟
每個晶片孔中加入100μl的1×封閉液，室溫搖床上孵育30min,避免產生氣泡;抽去封閉液，每個孔中新增100μl樣品，一個陣列一個樣品;4℃振盪過夜孵育。使用ThermoScientificWellwashVersa晶片洗板機清洗玻片，每孔加入70μl生物素標記抗體;室溫震盪孵育1~2h,清洗，每孔加入70μl的1500倍稀釋的熒光劑-鏈黴親和素，用密封條貼住玻片，然後用鋁箔紙包住玻片避光室溫震盪孵育1~2h.清洗，採用鐳射掃描器例如AxonGenePix掃描訊號。採用晶片分析軟體提取資料，對於Foldchange,選取大於1.5為有統計學意義。
1.4Westernblot檢測多能標誌
蛋白OCT4和NANOG兔抗人OCT4多株抗體購自Immunoa-way公司，鼠抗人NANOG單株抗體購自Millipore公司，二抗均購自碧雲天生物技術有限公司。293T細胞在6孔板中，一孔加培養基，一孔加50%終濃度的雞蛋白提取液，共培養3d後，用碧雲天的IP細胞裂解液提細胞蛋白，取50μl細胞蛋白液加10μl6×的上樣緩衝液，100℃水浴5min,上樣20μl,進行SDS-PAGE電泳，電泳結束後，100v電壓轉膜1h,膜用5%脫脂奶粉的TBS封閉37℃1h,將一抗1∶250稀釋於2%脫脂奶粉的TBS中，37℃振搖1h,TTBS洗3次，每次5min,二抗1∶200稀釋於2%脫脂奶粉的TBS中，37℃振搖1h,TTBS洗3次，每次5min,ECL顯色，用Tanon的化學發光成像儀檢測發光條帶。
2結果
2.1C57-BMSC有3個蛋白髮生了統計學意義的改變SOX17、BMPR-1A和NANOG是幹細胞中表達的蛋白，當體細胞向幹細胞轉變後細胞中這幾個蛋白的表達升高，我們用50%終濃度的雞蛋白提取液與C57-BMSC共培養3d後，這幾個蛋白的表達明顯升高，說明C57-BMSC又向更多能的幹細胞分化了，見圖1.
2.2TS-UC-MSC有1個蛋白髮生了統計學意義的改變BMPR-1A是幹細胞多能性的標誌，TS-UC-MSC用50%雞蛋白提取液共培養3d後，與未加雞蛋白提取液培養的細胞相比，BMPR-1A明顯升高，說明細胞又向多能幹細胞的方向分化了，見圖2.
2.3293T有1個蛋白髮生了統計學意義的改變BMPR-1A是幹細胞多能性的標誌，293T細胞是標準的體細胞株，用50%雞蛋白提取液共培養3d後，BMPR-1A表達明顯升高，說明293T細胞有向幹細胞轉變的現象發生，見圖3.
2.4293T-GFP有1個蛋白髮生了統計學意義的改變OCT4是幹細胞多能性的標誌，293T-GFP用50%的雞蛋白提取液共培養後，對比培養基培養的細胞OCT4的表達明顯增加，說明細胞有向幹細胞轉化的.現象。
2.5293T細胞OCT4和NANOG蛋白的Westernblot結果(圖5)OCT4和NANOG蛋白是幹細胞多能性的標誌，293T細胞用50%的雞蛋白提取液共培養後，OCT4和NANOG蛋白的表達量明顯增加(圖5和表1),與對照組(培養基培養)相比有統計學意義(P<0.05,n=3).
3討論
SOX17、BMPR-1A、NANOG和OCT4是幹細胞中表達的蛋白，在細胞轉化為多能的幹細胞時，這幾個蛋白的表達明顯升高。因此，這些蛋白在細胞中表達明顯升高時，可以認為細胞向多能的幹細胞發生了轉化。我們用共培養法發現加了50%雞蛋白提取液的細胞有一些幹細胞蛋白表達明顯升高，而現在用卵細胞提取液誘導體細胞核重程式設計的方法，通常用可逆滲透法，即先用鏈球菌溶血素O(SLO)在細胞膜上打孔，再用卵細胞提取液滲透，最後再用氯化鈣再封合細胞膜上的孔，是否這種方法誘導效率更高，需要今後的實驗進一步深入研究。
我們在實驗中用了4種細胞，C57小鼠的骨髓間充質幹細胞(C57-BMSC)、樹鼩的臍帶間充質幹細胞(TS-UC-MSC)、293T細胞(購自中國科學院昆明細胞庫)和GFP慢病毒轉染成功的293T細胞(293T-GFP),用50%的雞蛋白提取液共培養3d後，均檢測到了幹細胞相關蛋白表達的升高，說明了雞蛋白提取液有誘導細胞向多能幹細胞轉變的現象，因為多能標誌蛋白有意義地升高了。
對比豬卵提取液和蟾蜍卵提取液，雞蛋白提取液獲取更方便，獲取量更大，提取過程注意無菌操作，獲得的雞蛋白提取液無須過濾除菌就可用於細胞培養，有較大的應用價值。在我們以前的研究中，發現雞蛋白提取液有促細胞增殖的作用[4,5],還有促進多能因子OCT4和NANOG升高表達的作用[6,7],因此在本研究中我們進一步應用幹細胞蛋白晶片檢測更多的多能因子，同時使用4種細胞，都檢測到其中多能因子的升高表達，C57-BMSC有SOX17、BMPR-1A和NANOG這3個蛋白髮生了統計學意義的改變，TS-UC-MSC有BMPR-1A蛋白髮生了統計學意義的改變，293T有BMPR-1A蛋白髮生了統計學意義的改變，293T-GFP有OCT4蛋白髮生了統計學意義的改變，進一步驗證了雞蛋白提取液有誘導體細胞向多能細胞轉變的作用。
由於C57-BMSC和TS-UC-MSC是間充質幹細胞，它們經過誘導後多能因子進一步升高表達，是否證明了雞蛋白提取液含有某些逆向分化細胞的特殊物質，以及這些物質的鑑定和分離提取還有待實驗進一步驗證。
參考文獻：
[1]MiyamotoK,TsukiyamaT,YangY,-freeextractsfrommammalianoocytespartiallyinducenuclearreprogramminginso-maticcells[J]Reprod,2009,80(5):935-943.
[2]HansisC,BarretoG,MaltryN,earreprogrammingofhu-mansomaticcellsbyxenopuseggextractrequiresBRG1[J]Biol,2004,14(16):1475-1480.
[3]MiyamotoK,FurusawaT,OhnukiM,ogrammingeventsofmammaliansomaticcellsinducedbyXenopuslaeviseggextracts[J]eprodDev,2007,74(10):1268-1277.
[4]阮光萍，王金祥，劉菊芬，等.雞卵清提取液中小於3kDa的成分有促細胞增殖的作用[J].中國細胞生物學學報，2014,36(10):1350-1354.
[5]阮光萍，王金祥，龐榮清，等.雞卵細胞提取液有維持和增強細胞活性的關鍵作用[J].中國細胞生物學學報，2013,35(6):804-809.
[6]阮光萍，王金祥，姚翔，等.雞卵提取物促進293T細胞升高表達多能基因OCT4和NANOG[J].中國細胞生物學學報，2014,36(2):190-194.
[7]阮光萍，姚翔，劉菊芬，等.雞卵清提取液中大於3ku蛋白促細胞升高表達多能基因Oct-3/4和Nanog[J].中國組織工程研究，2014,18(37):6029-6033.