作者：李華 李勇 範立僑 趙雪峰 宋振川 趙群 王力利 焦志凱 劉羽
【摘要】 目的探討Runx3基因啟動子甲基化與胃癌發生發展過程的關係。方法採用逆轉錄?聚合酶鏈反應(RT?PCR)檢測80例胃癌組織及腫瘤周圍粘膜組織中Runx3 mRNA的表達,同時用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測Runx3基因啟動子甲基化情況。結果80例胃癌組織標本中Runx3基因的表達（0.5971±0.1013）較腫瘤周圍組織中表達明顯下調（0.8297±0.2912）,差異有統計學意義(P<0.05)。正常粘膜組織中未發現有Runx3基因啟動子的甲基化,80例胃癌組織中有43例檢測到Runx3基因啟動子的甲基化,胃癌組織Runx3基因啟動子甲基化率顯著增高(P<0.05)。胃癌標本中Runx3 mRNA的表達與其病理臨床特徵密切相關，在低分化和有淋巴結轉移胃癌組織標本中Runx3 mRNA的表達顯著下調(P<0.05)。結論Runx3基因啟動子甲基化是導致Runx3基因失活的主要原因之1並且與胃癌的發生、發展密切相關。
【關鍵詞】 胃癌；Runx3基因；RT?PCR；DNA甲基化
1資料與方法
1.1資料
1.1.1標本80例胃癌組織標本取自我院2005年1月~8月的手術切除標本，立即放液氮中速凍，-80℃凍存備用。同時選取癌旁5cm組織作為對照。年齡28~80歲，中位年齡57歲,男45例,女35例,有淋巴結轉移45例。所有標本術後均經病理證實。
1.1.2試劑Trizol 購自Invitrogen公司。cDNA第1鏈反應試劑盒購自Fermentas公司。PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成。DNA純化試劑盒購自Promega公司,氫酯和亞硫酸氫鈉購自SIGMA公司。
1.2方法
1.2.1組織總RNA提取將組織標本研磨後，採用Trizol試劑按照說明書提取組織樣本總RNA，備用。
1.2.2逆轉錄?多聚合酶鏈反應（RT?PCR）紫外分光光度計定量總RNA,調整濃度為1μｇ/μｌ。按cDNA第1鏈反應試劑盒說明書採用隨機引物法合成cDNA。用GAPDH做為內參照進行PCR。Runx3的引物序列：上游：5'?GATGGCAGGCAATGACGA?3'，下游：5'?TGCTGAAGTGGCTTGTGGT?3', 擴增長度：353bp。GAPDH的引物序列：上游：5'?AACGGATTTGGTCGTATTG?3', 下游：5'?GGAAGATGGTGATGGGATT?3'，擴增長度：208bp。PCR 引數: 94℃ 5min變性; 94℃ 45s, 55℃ 55s, 71℃ 45s, 32個迴圈; 72℃延伸7min。PCR產物於2%瓊脂糖電泳，電壓60V，55min。Gel ID凝膠影象分析系統攝片分析測定其光密度。計算各個樣本Runx3積分光密度（條帶強度× 條帶面積)與GAPDH內對照積分光密度的比值, 反映Runx3 mRNA表達的變化。
1.2.3DNA提取、純化和亞硫酸鹽修飾稱取150mg標本在未解凍時迅速用眼科剪剪碎,然後按DNA純化試劑盒說明書提取DNA。取1μg DNA加入50μｌ總體積中, 加2mol/L NaOH使其終濃度為0.2mol/L, 37℃變性處理10min。再加入新鮮配製10mmol/L氫酯20μｌ,520μｌ的亞硫酸氫鈉,置於50℃水浴16h,修飾後的DNA用Wizard DNA clean up system純化,加入NaOH (終濃度0.3mol/L)室溫變性5min,加入3mol/L的醋酸鈉中和後,乙醇沉澱回收DNA,此DNA溶於50μｌ TE緩衝液中, -20℃貯存備用。
1.2.4甲基化特異性PCR(Methylation 2specific PCR, MSP)甲基化特異性引物上游引物序列為5'? TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG ?3', 下游引物為5'? AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC ?3', 擴增片段為210bp。非甲基化特異性引物上游序列為5'? TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG ?3', 下游引物為5'? AAAACAACCAACACAAACAACTCC ?3', 擴增片段為210bp,反應體系總體積為25μｌ, 甲基化反應條件為94℃ 5min 預變性，94℃ 30s, 65.6℃ 45s,72℃ 55s,共35個迴圈, 72℃延伸5min。非甲基化反應條件為94℃ 5min 預變性，94℃ 30s,61.2℃ 45s, 72℃ 55s,共35個迴圈, 72℃延伸5min。PCR產物5μｌ於1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,紫外線下觀察拍照分析。
1.3統計學處理資料用±s 表示,採用SPSS10.0統計軟體行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
2結果
2. 1Runx3 mRNA在胃癌和癌旁組織中的表達Runx3和GAPDH引物的擴增基因片段經電泳和EB染色後，電泳結果顯示擴增片段大小分別為353bp和208bp。Runx3表達量相對值在胃癌及癌旁組織中的表達，見表1。表1Runx3基因mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達組織來源表達相對值（±s）tP胃癌組織0.5971±0.10136.7480＜0.01癌旁組織0.8297±0.2912表2Runx3基因甲基化在胃癌及癌旁組織中的表達組織來源甲基化表達(n)非甲基化
表達(n)χ2P胃癌組織433758.4360.001癌旁組織0802.2Runx3基因啟動子甲基化在胃癌和癌旁組織中的發生率Runx3基因甲基化檢測電泳染色後顯示，癌旁組織內未發現Runx3基因啟動子甲基化而胃癌組織標本中有53.75%(43/80)被檢測到，見表2。
2.3Runx3的表達與胃癌臨床病理相關因素的關係表3結果顯示, Runx3 mRNA的表達與胃癌的分化程度及淋巴結轉移有關(P＜0.05), 而與腫瘤部位及大小無關(P>0.05)。 表3胃癌組織Runx3基因mRNA
表達與臨床病理特徵的關係臨床病理因素例數Runx3 mRNAχ2值和P分化程度低分化314χ2=3.950高分化4916P=0.047淋巴結轉移有385χ2=5.414無4215P=0.020腫瘤大小<5cm5012χ2=0.071>5cm308P=0.790腫瘤部位胃竇4410χ2=0.269胃體3610P=0.604
3討論Runt家族包括3個基因，其家族成員均具有含123個氨基酸的Runt Domain (RD區域)，Runx蛋白與Smad2、Smad3形成複合物傳遞TGF?β/activin訊號，與人類疾病的發生密切相關。Runx3含有2個高度保守的`CpG島，其中1個富含GC啟動子的特徵CpG島較大，位於Runx3基因啟動子P2周圍，控制Runx3基因轉錄[1]。目前研究發現消化道腫瘤，如胃癌、膽管癌、胰腺癌和肝細胞癌中均有染色體1p36異常[6?7]。Runx3基因作為1種腫瘤抑制基因,與多種腫瘤的發生、發展相關。在45%~60%的胃癌細胞系和胃癌組織中，有緊鄰P2啟動區的CpG島的甲基化[8，9]。Li等研究發現在30%胃癌中有1p36.1的雜合性缺失，而Runx3的點突變則為1/119[10]。本研究結果表明胃癌中Runx3的表達量明顯低於正常粘膜組織，Runx3在伴有淋巴結轉移組中明顯低於未轉移組。說明在胃癌發生、發展過程中Runx3基因表達有缺失並且與胃癌分期有關，因此，近年來部分學者更傾向於Runx3基因是1種抑癌基因，在胃癌發生中起重要作用。Runx3基因表達缺失主要是由於Runx3基因啟動子甲基化所造成。本研究在正常粘膜組織中未發現有Runx3基因啟動子的甲基化，而在胃癌組織中有53.75%檢測到甲基化存在，這與文獻報道相似[11]。因此Runx3基因啟動子區域的高甲基化（CpG島甲基化）可能是導致基因轉錄失活及其表達下調的主要原因。Runx3基因啟動子區域高甲基化導致其在胃癌組織中表達明顯下調且與胃癌發生、發展密切相關。因此，利用藥物對Runx3基因進行去甲基化處理的進1步研究必將對胃癌的臨床診斷和治療帶來新的啟示。
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