癌症是人類面臨的最大難題，隨著分子生物學和基因工程的進展，使我們認識到腫瘤發生的關鍵是正常細胞內基因組發生了改變，基因改變是導致腫瘤的根本原因［1］。近期的研究結果顯示從腫瘤的誘發到進展是一個多階段、多因素的複雜過程，這個複雜過程包括腫瘤基因的啟用和腫瘤抑制基因的失活，腫瘤基因和腫瘤抑制基因分別以正性和負性調節細胞的生長，並參與腫瘤的形成［2］。到目前為止，人類已發現100多個癌基因和10多種抑癌基因。80年代中期抑癌基因被發現以來，其重要作用得到廣泛認可，抑癌基因(tumor supress gene)是正常細胞在調控細胞增殖、分化等方面起重要作用的基因，它在保持基因組結構穩定、促進細胞生長、誘導細胞凋亡等方面均有重要意義，它的缺失或失活可引起細胞內癌基因(oncogene)的活化，造成細胞的過度增生、分化，導致惡性腫瘤的發生和發展。癌基因和抑癌基因共同參與調節細胞週期活動的分子過程已為現今癌症研究的重要課題之一。研究腫瘤發病的分子生物學機制，瞭解各種腫瘤細胞增殖週期中調控因子的狀況，對於進行基因診斷、基因治療無疑具有重大意義。
1 p16(MTS1)基因的發現和基本結構
1992年美國Skolnick等在黑色素瘤患者中發現有與細胞週期蛋白依賴性激酶(CDK)相結合的蛋白，但這種蛋白的基因未被克隆出，隨後對100個黑色素瘤細胞系採用染色體步移法和序列標記位點圖進行分析，發現1/2的腫瘤細胞在染色體9p21區發生頻繁的基因突變，推測該區域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此後在許多人類腫瘤集及體外細胞系中均發現9p21區的缺失和突變。1993年，美國長島冷泉實驗室研究的細胞先驅Serano等利用酵母雙雜和蛋白相關性篩選法(yeast two-hybrid protein interaction screen)發現並分離了特異性的細胞週期素依賴性激酶4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16蛋白，證明p16與CDK4結合後cyclinD/CDK4複合物的催化作用明顯降低，並克隆了p16的cDNA。1994年美國鹽湖城Kamb等［3］和聖地亞哥的Nobori［4］分別報道發現一個新的抑癌基因：p16，兩個研究小組發表了一項重要的'研究成果發現一個新的抑癌基因：p16蛋白，證明p16與CDK4結合後cyclinD/CDK4複合物的催化作用明顯降低，並克隆了P16的cDNA。Kamb［3］在對黑色素瘤染色體9p21易感區應用物理圖(physical map)和序列標記位點圖(sequence tagged stites,STSs)分析了100個黑色素瘤細胞系的純合缺失，發現在兩個區域與Serrano報道的p16序列相近，命名為多發性腫瘤抑制因子1(multiple tumor suppress 1,MTS1)和MTS2，其中MTS1和p16完全吻合，而MTS2與p16序列有93%相同，現命名為p15(kamb A.S
cience,94,264,436-440)。p16基因位於人類的9號染色體短臂(9p21)上，由3個外顯子和2個內含子組成，外顯子1包括E1α和E1β，E1α，126bp；E1β，180bp；外顯子2 307bp；外顯子3 11bp。全長8.5kb，氨基酸序列分析表明成熟的p16分子量為15.84kD的單鏈多肽，含有一個由148個氨基酸組成的開放閱讀框架，具有一個有4個ankyrin序列組成(回鉤狀重疊的空間構型的蛋白結構)，這一構型為維持其活性所必需，參與蛋白與蛋白之間的作用［4］。
2 作用機制
細胞增殖分裂是細胞最基本的生理活動，越來越多的研究證明，細胞分裂週期的精確性及定時性是正常細胞生長和分化所必需的，細胞作為機體的最小單位，其生長過程總是處於一種增殖的動態平衡之中，這才能保證機體正常的生長、發育。這就意味著細胞內必然存在著促進和抑制增殖兩種體系［5］，包含於這一過程中的蛋白質及基因的改變與腫瘤發生及其惡性表形密切相關。典型的一個細胞週期包括有嚴格順序的4個期即G1SG2M，它是由MPF(maturation promoting factor,MPF)所推動。並受到訊號轉導途徑和反饋環路的精密調控。MPF含兩種蛋白質組分，其一為cdc2蛋白(cell division cycle 2 protein)，另一為細胞週期蛋白(cyclin)，在整個細胞週期中cdc2蛋白的濃度是穩定的，它的活動受到細胞週期蛋白的調節，細胞是否進入分裂週期以及分裂週期是否成功完成取決於其能否順利通過若干關卡(check points)，其中最重要的是G1/S轉換和G2/M轉換。前者又稱為“啟動點(start)”或“限制點(restriction point)”，位於G1期末，DNA合成的起始，後者位於M期的初始。現已證明，啟用的CDK在這兩個轉換過程中起關鍵作用［6］。在高等的真核細胞，細胞週期蛋白分為A、B、C、D、E五種，它們分別在細胞週期的不同時期積累，啟用相關細胞週期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性。G1期細胞週期蛋白是指在G1或G1/S交界處發揮作用啟動細胞週期並促進DNA合成的週期蛋白，有C、D、E等多種，其中cyclinD1能啟用CDK4、6調節G1/S轉換，促進細胞分裂週期由G1期進入到S期，進行DNA合成［7］，cyclinD實際上可以視為一種癌基因，其過度表達會導致細胞增殖失控。最重要的研究發現是CDK抑制因子與腫瘤生長密切相關，對於CDK抑制因子p21的研究首先證明了這一點，p21是作為含有PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在內的CyclinD-CDK四聚體複合物中的一員在正常人纖維母細胞中首先被發現的［7］。對p16的研究進一步闡明瞭CDK抑制因子在腫瘤發生發展中的作用。這就構成了cyclins(細胞週期素)-CDKs(細胞週期素依賴性蛋白激酶，cyclins dependent kinases)-CKIs(細胞週期素依賴性蛋白激酶的抑制蛋白，cyclins dependent kinases inhibitors)這一以CDKs為中心的細胞週期網路調控系統。p16通過與cyclinD競爭結合CDK4、CDK6抑制cyclinD/CDK4的活性，參與並調節細胞從G0期進入G1期，去除p16的抑制作用，將使細胞異常增殖，過度週期蛋白啟用和/或抑制蛋白的失活，都會導致CDKs的過度作用，導致細胞非正常增生。野生型抑癌基因Rb的蛋白產物PRb的活性是通過磷酸化作用獲得的，CDK4、CDK6作為PRb的激酶與此密切相關，Liu等［8］提出PRb發生磷酸化後，導致與PRb結合的TF(Transcription Factor)的釋放，如E2F，E2F是通過啟用與細胞增殖有關的基因，如DNA合成酶-α，從而調控細胞週期由G1期到S期，E2F與未磷酸化的PRb結合時沒有轉錄活性，但與磷酸化的PRb分離後將啟用p16基因轉錄，隨著p16 mRNA水平的增多，和CDK4、CDK6結合的p16也增多，致使cyclinD/CDK4、