【摘要】 目的: 研究硝酸甘油(GTN)對對乙醯氨基酚（AP）肝毒性的影響與機制. 方法： 小鼠ip GTN 0.1~1.6 mg/kg，15 min後ip AP 300 mg/kg，6 h後測定血清谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉氨酶(AST)；GTN（1.6 mg/kg）預處理小鼠，測定AP半數致死量（LD50）；熒光法測定肝蛋白S?亞硝基化水平；分光光度法測定肝穀氨酸脫氫酶(GDH)活性；S?亞硝基谷胱甘肽（GSNO）處理GDH純酶，Saville?Griess法測定其S?亞硝基化水平，並觀察對N?乙醯?p?苯醌亞胺（NAPQI）滅活GDH效應的影響. 結果： GTN降低AP導致的ALT，AST升高，使AP對小鼠LD50由321 mg/kg上升至762 mg/kg；GTN引起肝蛋白S?亞硝基化水平升高，使AP對肝GDH的抑制作用完全消失；GSNO誘發GDH純酶發生S?亞硝基化，且不影響酶活性，但修飾後的GDH不被NAPQI滅活. 結論： GTN可減輕AP肝毒性，其機制與誘發肝蛋白巰基S?亞硝基化，減少NAPQI與蛋白（如GDH）巰基的共價結合有關.
【關鍵詞】 對乙醯氨基酚；硝酸甘油；S?亞硝基化；穀氨酸脫氫酶；肝毒性；肝/藥物作用
0引言
對乙醯氨基酚(acetaminophen, AP)過量致肝實質細胞向心性壞死是西方國家急性肝功能衰竭的首要病因［1］．目前認為，過量AP經肝P450酶系代謝活化，產生N?乙醯?p?苯醌亞胺［N?acetyl?p?benzoquinone imine,(NAPQI)］，後者迅速與還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的巰基結合，使其耗竭後進而與蛋白巰基結合，破壞蛋白功能而引發毒性. 補充GSH是較為滿意的防治措施［1］. 本研究選用硝酸甘油（glyceryl trinitrate，GTN)誘導肝蛋白巰基發生S?亞硝基化修飾［2］，以保護蛋白巰基，減少或避免NAPQI攻擊，觀察是否可減輕AP肝毒性.
1材料和方法
1.1材料AP，NAPQI，2,3?二氨基萘（2,3?diaminonaphthalene, DAN），Griess試劑，牛肝穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)(美國Sigma公司)；5?磺基水楊酸（5?sulfosalicylic acid，SSA），GSH，氯化汞（HgCl2），亞硝酸鈉(美國Amresco公司)；谷丙轉氨酶（ALT），穀草轉氨酶（AST）活性測定試劑盒（寧波亞太生物技術有限公司）；GTN注射液（山東華信製藥有限公司）；超濾管（美國Millipore公司）；預裝脫鹽柱，熒光分光光度計，紫外分光光度計(美國Bio?rad公司)．雄性昆明小鼠，體質量18~20 g，由西安交通大學實驗動物中心提供.
1.2方法
1.2.1動物實驗方案實驗一:80只小鼠，禁食不禁水10 h，隨機分為8組，每組10只，分別ip給藥：GTN(0.1, 0.4, 1.6 mg/kg)，AP(300 mg/kg)，GTN+AP（先注射GTN，15 min 後注射AP），對照組ip等體積生理鹽水. 給藥後6 h摘眼球取血，製備血清，按照試劑盒說明書測定ALT和AST活性；同時取肝臟，稱質量後剪碎，以5倍體積50 mmol/L磷酸緩衝液(pH=7.4)勻漿，1000 g離心10 min，保留上清，取100 μL 測定GDH催化活性，其餘樣品脫鹽後測定蛋白S?亞硝基化水平. 實驗二：測定LD50，採用140只小鼠，隨機分為14組，每組10只，禁食15 h，其中7組ip GTN 1.6 mg/kg，另7組ip等體積生理鹽水，15 min後均ip AP：生理鹽水組AP劑量分別為800，571，408，292，208，149，106 mg/kg，GTN預處理組AP劑量分別為1500，1071，765，547，390，279，199 mg/kg；AP加熱至50℃溶解，給藥容積為15 mL/kg；觀察給藥後24 h內各組小鼠死亡率，計算LD50.
1.2.2GDH催化活性測定按照文獻［3］進行.
1.2.3熒光法測定肝蛋白S?亞硝基化水平蛋白濃度調整為5 g/L，取1 mL進行實驗，樣品等分為二，一份加入HgCl2分解S?亞硝基化蛋白，釋放一氧化氮（nitric oxide, NO）與DAN（溶解於0.62 mol/L HCl）反應，生成熒光物質，另一份加入HgCl2的溶劑作為對照，樣品調pH為中性後加SSA沉澱蛋白，離心取上清，測定熒光強度，激發波長380 nm，吸收波長450 nm，以亞硝酸鈉做標準曲線，折算蛋白S?亞硝基化水平［4］.
1.2.4S?亞硝基谷胱甘肽（S?nitrosoglutathione，GSNO）的合成與定量200 mmol/L亞硝酸鈉與200 mmol/L GSH（均溶解於0.5 mol/L HCL）等體積混合，室溫避光反應5 min，得紅色產物，用1 mol/L NaOH調pH至中性，以消光係數定量［5］.
1.2.5GDH與GSNO及NAPQI反應GDH透析除去硫酸銨，蛋白濃度調整為1 g/L，取1 mL與等體積GSNO（終濃度0，20，200，2000 μmol/L）室溫避光反應30 min，採用脫鹽柱去除過量GSNO，一半樣品用於測定GDH催化活性，並以Saville?Griess法測定酶蛋白S?亞硝基化水平［6］，剩餘樣品調整蛋白濃度為0.25 g/L，取1 mL加入NAPQI 1 μL，使其終濃度為10, 30, 90 μmol/L， 室溫反應30 min，利用超濾管進行脫鹽濃縮，測定GDH催化活性與S?亞硝基化水平［6］；上述實驗均重複5次.
統計學處理：資料以x±s表示，用SPSS 13．0軟體包進行方差分析(ANOVA)，多重比較採用LSD?t檢驗法，組間方差不齊時，採用非引數秩和檢驗法，採用Bliss法計算LD50.
2結果
2.1GTN改善AP導致的血清生化指標改變小鼠單獨注射AP 300 mg/kg，血清ALT和AST較對照組均升高（P<0.05）；單獨注射GTN，各劑量組均不影響ALT和AST活性；GTN與AP合用，血清AST和ALT較單用AP降低（P<0.05），但與對照組比較，ALT和AST仍偏高（P<0.05，表1）. 在GTN劑量方面，預實驗發現，GTN劑量達到50 mg/kg時，小鼠全部死亡；劑量小於0.05 mg/kg時，保護作用幾乎消失；劑量大於2.0 mg/kg 時, 保護作用逐漸減弱. 表1硝酸甘油和對乙醯氨基酚對小鼠血清生化指標的影響