摘要： 目的 探討Nogo受體拮抗劑NEP1-40對大鼠脊髓損傷後脊髓功能恢復的影響，為臨床治療急性脊髓損傷提供實驗依據。方法 健康Wistar大鼠48只隨機分為創傷對照組、NEP1-40治療組。建立大鼠中段胸部脊髓後半部橫切模型。對照組注入生理鹽水，實驗組採用NEP1-40治療。分別在術後取材行蘇木精-伊紅染色、免疫熒光染色檢測。術後第1、3天及1、2、3、4周對動物進行運動功能評分。結果 脊髓損傷3周後，NEP1-40組行為學評分高於對照組，同時NeuN/NF-200陽性染色亦明顯高於對照組，差異有統計學意義。結論 NEP1-40治療脊髓損傷能促進神經元的再生，恢復脊髓功能。
關鍵詞： 大鼠；脊髓損傷；Nogo受體拮抗劑；再生
脊髓少突膠質細胞所分泌的Nogo蛋白是目前已知最強的神經軸突生長抑制因子，對受損神經元再生具有極強的抑制作用［1］。Nogo受體拮抗劑(Nogo extracellular peptide, residues 1-40，NEP1-40)為針對Nogo-66氨基序列設計的Nogo受體(Nogo receptor，NgR)競爭性拮抗劑，能拮抗中樞神經抑制因子與NgR的結合，起到促進神經再生的作用［1-2］。本實驗主要觀察NEP1-40對於急性脊髓損傷大鼠運動功能的影響及對NF-200表達的影響，並進一步探討NEP1-40治療急性脊髓損傷的療效和可能機制。
1 材料和方法
1.1 主要試劑
NEP1-40、兔抗大鼠NeuN 抗體、小鼠抗大鼠NF-200抗體、抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-RBITC，均購自北京博奧森生物技術有限公司。
1.2 動物及分組
健康成年Wistar大鼠48只(由蘇州大學實驗動物中心提供)， 雌性，體重250～300 g，隨機分為生理鹽水對照組、NEP1-40實驗組。
1.3 動物模型的製作
參照Brosamle等［3］方法制作脊髓半橫斷模型。大鼠經腹腔麻醉後固定於立體定位儀上，常規消毒，以第8胸椎(T8)棘突為中心，手術顯露棘突。手術顯微鏡下開啟T8椎板，用刀片做T10脊髓的後半橫斷，損傷深度1.0 mm（橫斷後側和後外側皮質脊髓束）。向尾側硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10導管，BD公司），鹽水沖洗切口，固定硬脊膜管，依次縫合，模型製作完成。
生理鹽水對照組通過置管每天注入生理鹽水20 μl，NEP1-40組每天用微量進樣器注入NEP1-40 10 μl(0.4 μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完畢後用10 μl生理鹽水衝管，以保證藥物進入蛛網膜下腔，連續使用4周。術後人工擠壓膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。術後3天給予青黴素4萬U／只。硬脊膜管外口予無菌保護，定期換藥。
1.4 標本的收集和處理
所有動物均分別於脊髓損傷1、2、3、4周時用4%多聚甲醛經左心室-主動脈灌注後取出脊髓組織，灌注液中固定12 h左右，然後放入30%蔗糖溶液中，待組織沉底，冰凍切片機切片，厚度30 μm。
1.5 檢測指標
1.5.1 組織學檢查
蘇木精-伊紅染色，觀察脊髓的組織學改變。
1.5.2 免疫熒光組織化學雙重標記染色
選取脊髓切片經兔抗大鼠NeuN 抗體(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗體(1∶400)4℃孵育過夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC (1∶100)37℃孵育1 h，封片後用Leica鐳射共聚焦掃描顯微鏡觀察免疫熒光雙標結果。
1.6 運動功能評定
採用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］運動評分法。在80 cm×130 cm×30 cm覆蓋有防滑紙板的箱子中，每隻實驗鼠由2名非實驗人獨自觀察4 min，對後肢的運動功能進行評分。0～21分的分級是根據關節的運動、體重的支撐、前後肢的.協調和尾的位置等情況而定。0分代表大鼠後肢無運動，21分表示大鼠後肢運動功能正常。BBB評分分別於術後第1、3、7、14、21、28天進行。
1.7 影象分析
免疫組化染色結果採用德國KONTRONIBAS 2.5全自動影象分析系統，在損傷的頭尾兩側，分別取10個視野，計算免疫熒光陽性神經細胞數。