【摘要】 目的從廣東土牛膝中製備咽炎方合劑中的特徵成分12,13-二羥基澤蘭素對照品。方法結合液液萃取、矽膠柱色譜、製備型高效液相色譜(HPLC)對廣東土牛膝醇提物進行分離純化，通過紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)等進行結構鑑定，分析型HPLC和薄層色譜(TLC)進行含量測定。結果製得的對照品為12,13-二羥基澤蘭素，含量大於98.0%。結論該化合物可作為廣東土牛膝及咽炎方合劑的質量控制以及藥效物質基礎研究用的化學對照品。
【關鍵詞】 廣東土牛膝; 咽炎方合劑; 12,13-二羥基澤蘭素; 對照品
Abstract：Objective To prepare 12,13-dihydroxyeuparin reference substance from Radix Eupatorii Chinensis, the characteristic composition in Yanyanfang Mixture. MethodsThe extract of Radix Eupatorii Chinensis was isolated and purified by liquid-liquid extraction, silica gel column chromatography and preparative high performance liquid chromatography(HPLC). The structure of 12,13-dihydroxyeuparin was identified by ultraviolet spectra (UV), infrared spectra(IR), mass spectra(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR). The content was determined by analytical HPLC and thin-layer chromatography (TLC)ltsThe content of the product was higher than 98%lusionThe compound can be used as a reference substance for quality control and the research of pharmacodynamic action.
Key words：Radix Eupatorii Chinensis; Yanyanfang Mixture; 12,13-dihydroxyeuparin; Reference substance
廣東土牛膝Radix Eupatorii Chinensis為菊科植物華澤蘭Eupatorium chinense L.的乾燥根，具有清熱解毒、涼血利咽、抗炎鎮痛的功效[1,2]，有喉科聖藥之稱。以廣東土牛膝為主藥的複方製劑在廣東地區的醫院裡被廣泛使用，但國內有關廣東土牛膝在複方製劑中的特徵成分未見報道。本實驗對廣東土牛膝藥材及其複方製劑咽炎方合劑(中山大學附屬第一醫院研製)進行化學成分研究，首次從該植物中分離得到12,13-二羥基澤蘭素(12,13-dihydroxyeuparin)，符合中藥化學對照品的相關要求[3,4]，可用於該藥材和咽炎方合劑的質量控制和藥效物質基礎研究。
1 儀器與材料
BIO-RAD製備型液相色譜儀，Waters1525分析型高效液相色譜儀(2996PAD檢測器，Empower色譜工作站)，Bruker AvanceⅢ 400MHz核磁共振波譜儀，島津LCMS-IT-TOF質譜儀，Bruker Tensor 37傅立葉變換紅外光譜儀，SRS Optimelt熔點測定儀，WFH-203B三用紫外分析儀，亞榮RE-300旋轉蒸發器。
廣東土牛膝購於廣州市藥材公司，由中山大學藥學院徐新軍博士鑑定，咽炎方合劑由中山大學附屬第一醫院提供。薄層矽膠和柱層析矽膠(青島海洋化工廠);甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
2.1.1 分析型HPLC：迪馬Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);檢測波長205～400 nm;柱溫為室溫，流速1 ml·min-1，進樣量20 μl。流動相為0.2%磷酸水溶液-乙腈梯度1洗脫(咽炎方製劑分析)：0～10 min，乙腈10%;10～40 min，乙腈10%～40%;40～60 min，乙腈40%～60%。0.2%磷酸水溶液-乙腈梯度2洗脫(藥材萃取物分析)：0～10 min，乙腈10%;10～40 min，乙腈10%～40%;40～50 min，乙腈40%;50～65 min，40%～80%乙腈;65～80 min，乙腈80%。0.2%磷酸水溶液-乙腈(80∶20，對照品純度分析)。
2.1.2 製備型HPLCKromasil C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)，流動相為水-甲醇(65∶35);檢測波長254 nm，流速5 ml·min-1，進樣量0.5 ml。
2.2 廣東土牛膝在咽炎方合劑中的特徵成分確定咽炎方合劑系由廣東土牛膝、崗梅、甘草等中藥水煎煮濃縮而成，廣東土牛膝是方中君藥。用HPLC對咽炎方合劑、廣東土牛膝水煮液和乙醇提液、咽炎方缺廣東土牛膝陰性溶液進行分析，選擇廣東土牛膝在製劑中峰面積最大的成分作為分離純化目標。如圖1所示，峰1為咽炎方合劑與廣東土牛膝水煮液相對應的色譜峰，確定其為目標化合物。由於峰1在廣東土牛膝乙醇提取液中含量較高，選擇用95%乙醇提取廣東土牛膝藥材，製取浸膏供分離對照品用。
2.3 對照品的分離與製備取廣東土牛膝藥材3 kg，粉碎，95%乙醇迴流提取2次，1.5 h/次。合併提取液，減壓濃縮，得乙醇提取物50 g。取乙醇提取物與水混懸，依次以石油醚、乙醚、正丁醇萃取，得石油醚萃取物23 g，