作者：薛美蘭 張秀珍 馬愛國 姜秀波 張金玉
【摘要】 目的 觀察大劑量維生素C（VC）對外周血淋巴細胞增殖活性、抗DNA氧化損傷能力以及紅血球膜流動性的影響。方法 將48只Wistar大鼠隨機分為對照組、A、B、C共4組，分別給予含VC為0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的飼料，實驗期為8周。實驗結束後無痛處死動物並取血，測定血漿VC、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，紅血球膜谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）活性、紅血球膜流動性、淋巴細胞增殖活性，單細胞凝膠電泳計數彗星細胞測量DNA氧化損傷水平。結果 與對照組比較，A組血漿SOD活性明顯增高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），血漿MDA含量明顯降低(F=4.176,q=4.23，P<0.05)，紅血球膜流動性和外周血淋巴細胞增殖活性均明顯增高（F=2.278～2.763,q=3.67-3.84，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD和紅血球膜GSH?Px活性明顯降低（F=2.987、3.478,q=3.68～4.13，P均<0.05），MDA含量明顯增高（q=4.08，P<0.05）。10 μmol/L H2O2誘發DNA損傷B組和C組較對照組均加重（F=4.137,q=3.94、4.25，P<0.05）。結論 較高劑量VC（2 000 mg/kg）可明顯增高大鼠機體的抗氧化損傷水平，改善紅血球膜流動性，提高淋巴細胞的增殖活性；當VC劑量超過5 000 mg/kg時，反而會加重淋巴細胞的DNA氧化損傷。
【關鍵詞】 抗壞血酸；超氧化物歧化酶；膜流動性；淋巴細胞活化；DNA損傷
維生素C（VC）是一種水溶性維生素，具有抗氧化活性。一般認為VC是水溶性的，不能在體內蓄積，攝入較高劑量不會對機體產生危害。已知超大劑量服用VC會產生副作用，包括胃脹氣、腹瀉、嘔吐等。有一項體外研究指出，VC抗氧化作用與其劑量有密切關係[1]，過大劑量的VC（0.5 mmol/L）可能增加細胞DNA對H2O2或其他有害物質損害的敏感性。目前，健康機體攝入高劑量的VC是否有不良影響尚無定論。本實驗通過體內實驗對大鼠進行超出生理需要量數倍的大劑量VC干預，觀察大劑量VC對健康幼年大鼠外周血淋巴細胞增殖活性和抗DNA氧化損傷能力以及紅血球膜流動性的影響及其可能機制。現將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 動物分組及處理
幼年Wistar大鼠48只，雌雄各半，分籠飼養，體質量80～100 g，由山東大學實驗動物中心提供。基礎飼料適應性餵養1周後，隨機分為對照組、A、B、C共4組，每組12只，分別給予含VC為0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的飼料（在基礎飼料中新增VC並充分混勻，低溫壓制並經迴圈風自然乾燥，飼料製成後立即放入-20 ℃冰箱中儲存）。各組動物自由飲水，環境溫度維持在23～25 ℃。實驗期為8周。基礎飼料的成分組成（%）：麵粉20，玉米粉30，豆麵15，麩皮25，魚粉5，骨粉1，食鹽1，酵母粉1，色拉油2，核黃素0.004，魚肝油0.04。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 血樣採集 大鼠處死前12 h撤掉食物，應用200 g/L的烏拉坦麻醉後經腹主動脈取血，留取800 μL紅血球，按低滲一步溶血法[2]製備紅血球膜備用，並同時分離淋巴細胞。其餘全血離心獲取血漿置於-20 ℃冰箱中儲存待測。
1.2.2 血漿VC測定 採用2，4?二硝基苯肼法。
1.2.3 血漿超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及紅血球膜谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）活性測定SOD活性測定採用羥胺法，GSH?Px活性測定採用DTNB直接法，MDA含量測定採用硫代巴比妥酸比色法。SOD、GSH?Px、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2.4 紅血球膜流動性測定 採用Lowry法測蛋白，調整膜蛋白的濃度為200～800 mg/L, DPH熒游標記紅血球膜。應用美國PE公司LS?50型熒光分光光度計測熒光偏振度，Ex 362 nm，Em 432 nm，狹縫10 nm，溫度25 ℃，按文獻[4]公式計算熒光偏振度P值和微黏滯度η值。
1.2.5 外周血淋巴細胞增殖活性的測定 採用ELX 2800酶標儀(美國BioTek公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定。
1.2.6 DNA氧化損傷分析 採用單細胞凝膠電泳或彗星電泳技術檢測[3]，取新鮮抗凝血30 μL，經分離獲取淋巴細胞，分別應用0、10、25 μmol/L的H2O2氧化處理5 min。將DAPI熒光染色的細胞核在熒光顯微鏡下觀察100個“彗星”細胞，根據拖尾的長度衡量DNA鏈斷裂損傷程度（AU）[4]。
1.3 統計學處理
採用SPSS 11.0和PPMS 1.5[5]統計軟體進行資料處理，資料間比較採用單因素方差分析。
2 結果
2.1 各組血漿VC、SOD、MDA含量和紅血球膜GSH?Px活性比較
與對照組比較，A組血漿SOD活性升高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），MDA含量顯著下降（F=4.176,q=4.23，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD活性明顯下降（q=4.13，P<0.05），MDA含量明顯升高（q=4.08，P<0.05），紅血球膜GSH?Px 活性明顯下降（F=3.475,q=3.68，P<0.05）。與A組比較，B組和C組MDA含量明顯升高（q=4.73～5.20，P<0.01），SOD活性明顯下降（q=3.58～3.65，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（q=4.51，P<0.01），紅血球膜GSH?Px 活性明顯下降（q=3.84，P<0.05）。 見表1。
表1 各組血漿VC、SOD、MDA含量和紅血球膜GSH?Px活性比較（略）
與對照組比較，F=2.987～4.176，*q=3.68～4.63，P<0.05；與A組比較，#q=3.58～5.20，P<0.05
2.2 各組大鼠淋巴細胞增殖活性的比較
對照組淋巴細胞增殖活性為0.042±0.036，A組為0.111±0.115，B組為0.049±0.059，C組為0.041±0.047。與對照組比較，A組的外周血淋巴細胞增殖活性明顯升高（F=2.278，q=3.67，P<0.05）；與A組比較，C組的淋巴細胞增殖活性明顯降低（q=4.19，P<0.05）。
2.3 各組大鼠紅血球膜流動性的比較
與對照組比較，A組紅血球膜P、η值顯著升高（F=2.458、2.763，q=3.84、4.23，P<0.05）；與A組比較，C組紅血球膜P、η值顯著下降（q=4.61、6.54，P<0.01）。見表2。