關鍵詞： 凝血酶原； 凝血酶； 等電點沉澱法； 檸檬酸鋇吸附法
凝血酶是參與機體凝血過程的一個重要的凝血因子，在體內以凝血酶原形式存在［1］。20世紀中期開始人們將凝血酶應用於臨床，由於其療效顯著，應用也越來越廣泛。之後美英日等國從牛血漿中分離出凝血酶應用於臨床，並證明將動物凝血酶應用於人體未出現凝血酶抗原性，口服和區域性外用時無過敏反應和其他不良反應等，因而目前所使用的凝血酶製劑大多來源於動物血漿，國內採用豬血漿製備凝血酶的報道較多［2］。等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原經單獨的鈣離子啟用可得到凝血酶。目前，國內尚無研究比較應用等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法所得到的凝血酶原純度的差異，哪種方法得到的凝血酶原純度更高？更適合用於提取凝血酶原?本文對這兩種方法從豬血漿中提取凝血酶原的純度進行了比較。為相關實驗中選擇合適的凝血酶原提取方法提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。
1.2 主要試劑
纖維蛋白原和凝血酶標準品購自美國SIGMA公司，Bradford蛋白質定量檢測試劑盒購自美國Bio?Rad。其餘試劑均為國產分析純。
檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH6.5.
1.3 主要儀器
GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析儀。
1.4 方法
1.4.1 凝血酶原提取 將收集到的5份豬血漿按1～5編號，各均分為2份，其中1份採用等電點沉澱法提取凝血酶原，另1份採用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。
等電點沉澱法 豬血漿用蒸餾水稀釋10倍，用5 %冰乙酸將其pH調至5.3，4℃靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，棄上清，沉澱用生理鹽水溶解，過濾備用。
檸檬酸鋇吸附法 豬血漿中加入溶液A，體積比為10∶1，4℃攪拌30 min，靜置30 min後，3 000 r/min離心30 min，棄上清。沉澱用溶液B洗滌，3 000 r/min離心15 min，棄上清。重複洗3次。沉澱用溶液C解吸附，4℃攪拌0.5～1h，3 000 r/min離心15 min取上清。上清液用溶液D於4℃透析過夜。3 000 r/min離心15 min取上清液，即為凝血酶原溶液。
1.4.2 凝血酶原啟用 用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調至7.1，加入0.25 mol/L CaCl2溶液，使Ca2 終濃度為0.03 mol/L，再用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調至7.1，室溫靜置2 h，過濾即得凝血酶溶液。
1.4.3 凝血酶比活性測定 根據文獻［4］提供的方法配製0.1 %纖維蛋白原溶液。
凝血酶效價測定［4,5］：取凝血酶標準品，用生理鹽水配製成效價(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標準品溶液。另取1×10 cm的塑料試管6支，各加入0.1 %纖維蛋白原溶液450 μl，置37℃水浴預熱5 min，再分別取已37℃預熱的上述6個濃度的標準品溶液各50 μl，迅速加入上述各試管中，立即計時並搖勻，記錄凝固時間。每個濃度測2次，求平均值，做標準曲線。待測樣品用生理鹽水稀釋適當濃度，取50 μl，按標準曲線的測定方法平行測定2次，求平均值，根據標準曲線或迴歸方程計算樣品的效價。