【摘要】 目的 比較等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原的純度。方法 分別採用等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原，凝血酶原經單獨鈣離子啟用得到凝血酶，通過凝血酶效價測定、蛋白質濃度測定，計算出凝血酶的比活性。結果 採用等電點沉澱法提取的凝血酶原經啟用後得到的凝血酶比活性為11.01±1.54 U/mg，採用檸檬酸鋇吸附法提取的凝血酶原經啟用後得到的凝血酶比活性為130.17±12.30 U/mg，經配對T檢驗，P＜0.01.結論 與等電點沉澱法相比，採用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取得到的凝血酶原純度更高。
【關鍵詞】 凝血酶原； 凝血酶； 等電點沉澱法； 檸檬酸鋇吸附法
Comparative Analysis of Two Extraction Methods of Prothrombin
LAI Yi,WU Min?lu,DAI Juan,CHEN Man,DUAN Jia?hui,LIU Yang* 畢業論文網 論文網
(Department of Lab Medicine,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China)
【Abstract】 Objective To compare the purity of prothrombin purified by method of precipitating at isoelectricpoint and adsorption method with barium citrate from blood plasma of ods Prothrombin was purified by method of precipitating at isoelectricpoint and adsorption method with barium citrate from blood plasma of pig and activated by Ca2+ only to the titer of thrombin and the concentration of protein were measured to get the specific activity of lts The specific activity of thrombin activated by Ca2+ from prothrombin purified by method of precipitating at isoelectricpoint was 11.01±1.54 U/ specific activity of thrombin activated by Ca2+ from prothrombin purified by adsorption method with barium citrate was 130.17±12.30 U/ specific activities were analyzed by paired T?test,P＜lusion The purity of prothrombin purified by adsorption method with barium citrate is higher than purified by method of precipitating at isoelectricpoint.
【Key words】 prothrombin； thrombin； method of precipitating at isoelectricpoint； adsorption method with barium citrate
凝血酶是參與機體凝血過程的一個重要的凝血因子，在體內以凝血酶原形式存在［1］。20世紀中期開始人們將凝血酶應用於臨床，由於其療效顯著，應用也越來越廣泛。之後美英日等國從牛血漿中分離出凝血酶應用於臨床，並證明將動物凝血酶應用於人體未出現凝血酶抗原性，口服和區域性外用時無過敏反應和其他不良反應等，因而目前所使用的凝血酶製劑大多來源於動物血漿，國內採用豬血漿製備凝血酶的報道較多［2］。等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原經單獨的鈣離子啟用可得到凝血酶。目前，國內尚無研究比較應用等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法所得到的凝血酶原純度的差異，哪種方法得到的凝血酶原純度更高？更適合用於提取凝血酶原?本文對這兩種方法從豬血漿中提取凝血酶原的純度進行了比較。為相關實驗中選擇合適的凝血酶原提取方法提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。
1.2 主要試劑
纖維蛋白原和凝血酶標準品購自美國SIGMA公司，Bradford蛋白質定量檢測試劑盒購自美國Bio?Rad。其餘試劑均為國產分析純。
檸檬酸鋇吸附法使用的`四種溶液分別為，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH6.5.
1.3 主要儀器
GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析儀。
1.4 方法
1.4.1 凝血酶原提取 將收集到的5份豬血漿按1～5編號，各均分為2份，其中1份採用等電點沉澱法提取凝血酶原，另1份採用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。
等電點沉澱法 豬血漿用蒸餾水稀釋10倍，用5 %冰乙酸將其pH調至5.3，4℃靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，棄上清，沉澱用生理鹽水溶解，過濾備用。
檸檬酸鋇吸附法 豬血漿中加入溶液A，體積比為10∶1，4℃攪拌30 min，靜置30 min後，3 000 r/min離心30 min，棄上清。沉澱用溶液B洗滌，3 000 r/min離心15 min，棄上清。重複洗3次。沉澱用溶液C解吸附，4℃攪拌0.5～1h，3 000 r/min離心15 min取上清。上清液用溶液D於4℃透析過夜。3 000 r/min離心15 min取上清液，即為凝血酶原溶液。
1.4.2 凝血酶原啟用 用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調至7.1，加入0.25 mol/L CaCl2溶液，使Ca2+終濃度為0.03 mol/L，再用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調至7.1，室溫靜置2 h，過濾即得凝血酶溶液。
1.4.3 凝血酶比活性測定 根據文獻［4］提供的方法配製0.1 %纖維蛋白原溶液。
凝血酶效價測定［4,5］：取凝血酶標準品，用生理鹽水配製成效價(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標準品溶液。另取1×10 cm的塑料試管6支，各加入0.1 %纖維蛋白原溶液450 μl，置37℃水浴預熱5 min，再分別取已37℃預熱的上述6個濃度的標準品溶液各50 μl，迅速加入上述各試管中，立即計時並搖勻，記錄凝固時間。每個濃度測2次，求平均值，做標準曲線。待測樣品用生理鹽水稀釋適當濃度，取50 μl，按標準曲線的測定方法平行測定2次，求平均值，根據標準曲線或迴歸方程計算樣品的效價。
根據文獻［6］，採用Bradford法測定樣品的蛋白質濃度，以牛血清白蛋白為標準品，每個樣本平行測2次，取平均值。根據公式：酶比活性=酶效價/溶液蛋白質濃度，計算凝血酶溶液的比活性。
2 結果與分析
以凝血酶標準品溶液效價 (U/mL)為X，對應的凝固時間（sec）為Y進行直線迴歸處理，並求得直線迴歸方程，所得方程式為：Y=62.913?5.994X，r≈0.994 8.將凝血酶樣品的凝固時間代入迴歸方程，即可計算得出樣品的凝血酶效價(見表1、圖1)。
採用等電點沉澱法得到的凝血酶原經啟用後，凝血酶的比活性為11.01±1.54 U/mg，而採用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經啟用後，凝血酶的比活性可達到130.17±12.30 U/mg。其比活性經配對樣本t檢驗統計學分析後，其概率P=3.54×10?5＜0.01，說明兩種方法得到的凝血酶比活性有顯著性差異，後者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質濃度分析，造成兩者酶比活性差異的主要原因在於凝血酶的純度差異，凝血酶純度越高，比活性就越高。等電點沉澱法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多，需要進一步純化，以提高酶的比活性。因而，採用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優於等電點沉澱法，得到的凝血酶純度較高。畢業論文網 論文網
3 討論
從血漿中提取的凝血酶可應用於臨床，作為區域性止血的首選藥物，具有止血快、無副作用的優點。同時，凝血酶也是纖維蛋白原定量檢測試劑盒的主要成分，應用於出凝血疾病和血栓性疾病的臨床檢測［7］。由於人血漿資源的限制性，目前國內採用豬血漿提取凝血酶的報道較多，等電點沉澱法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法，凝血酶原經單獨的鈣離子啟用即可得到凝血酶。表1 兩種提取方法所得到的凝血酶比活性
等電點沉澱法根據蛋白質在溶
[1]