紫杉醇和吉西他濱對鼻咽癌HNE2細胞系 協同放射增敏的作用

【摘要】目的觀察紫杉醇、吉西他濱兩藥聯合對鼻咽癌細胞系HNE2的放射增敏作用，並探討其可能機制。方法將HNE2細胞分為單純照射組、吉西他濱（GE）＋照射組、紫杉醇（PA）＋照射組及GE PA 照射組，用克隆形成實驗計算兩藥物單用及合用的放射增敏比，流式細胞儀法分別檢測、比較各組的細胞凋亡率及細胞週期變化。Westernblot法測定各組細胞凋亡相關基因bcl?2、bax的表達水平。結果吉西他濱、紫杉醇及兩藥聯合使用的放射增敏比分別為1.06、1.13和1.34。流式細胞儀檢測顯示吉西他濱聯合射線主要誘導S期阻滯（96.03％），誘導凋亡率為31.62％；紫杉醇聯合射線引起的阻滯以G2＋M期為主（75.71%），誘導細胞凋亡率為44.56%；兩藥合用並聯合照射後G2＋M期比例（65.98%）有所下降，同時S期比例（33.33%）有所上升（與PA 放射組比較），細胞凋亡率達到73.28%。在四組中bcl?2的表達呈逐步下降趨勢，而bax的表達則呈逐步上升趨勢。結論吉西他濱、紫杉醇單用及兩藥聯合對鼻咽癌細胞系HNE2均有放射增敏作用，且兩者協同增敏作用顯著高於單獨增敏作用，顯示了兩藥聯合應用有助於提高鼻咽癌的放射敏感性。兩者協同放射增敏作用的機制可能與凋亡有關。

【關鍵詞】紫杉醇吉西他濱鼻咽癌放射增敏

0引言

放射治療一直是治療鼻咽癌的首選方法。近年來已有作者報道分別將紫杉醇[1]（Paclitaxel，PA）和吉西他濱[2]（Gemcitabine，GE）聯合放射治療鼻咽癌，以增加其放射敏感性，但兩藥聯合使用增加放射敏感性的報道尚屬少見。本試驗選用鼻咽癌細胞株HNE2作為研究物件，研究了紫杉醇和(或)吉西他濱聯合放射對HNE2細胞增殖、凋亡的影響，以探討PA和GE協同作用對HNE2細胞的放射敏感性的影響及其可能機制。

1材料和方法

1.1細胞株、藥物和試劑人鼻咽癌HNE2細胞株購自湖南湘雅醫學院腫瘤研究所。紫杉醇和吉西他濱分別為美國百時美施貴寶公司及禮來公司產品。兔抗人多克隆第一抗體及生物素標記的第二抗體由北京中山生物技術有限公司提供，系美國SantaCruz產品。噻唑藍（MTT）、二甲基亞碸（DMSO）購自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶購自GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2細胞及培養條件人鼻咽癌HNE2細胞株培養於含有10%胎牛血清的PRMI1640培養基中，新增100IU/ml青黴素及鏈黴素，37℃、100%溼度、5%CO2條件下常規培養。

1.3MTT法測定藥物IC50及IC10值HNE2細胞按103/孔接種於96孔培養板，待16～18h後貼壁生長至對數生長期時，將PA用培養基依次稀釋為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml，分別按100μl/孔加入96孔板，每一濃度設3復孔，並設正常對照孔及空白調零孔。同法將HNE2細胞按5×103/孔接種於96孔培養板，GE依次稀釋為2000μg/ml、200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml加入96孔板。置37℃培養箱孵育24h後，棄去藥物及陳舊培養基，每孔加新鮮配製的'MTT（5mg/ml）20μl再次孵育4h，棄去MTT液，每孔加DMSO150μl，振盪15min，酶聯免疫檢測儀於490nm波長測定吸光度D。重複3遍。腫瘤細胞抑制率＝（1?實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%

1.4克隆形成實驗測定藥物放射增敏性將正常細胞、GE作用24h後細胞、PA作用24h後細胞及兩藥聯合作用（濃度同上）24h後細胞組常規消化後分別按不同照射劑量以不同密度接種於60mm培養皿，每組細胞給予6MVX射線單次照射0、2、4、6、8Gy，恆溫箱中培養12d。12d後取出培養皿，棄去培養基，PBS清洗2遍，甲醇固定15min，去除固定液，姬姆薩染色30min，對含50個細胞以上的克隆進行計數。多靶單擊模型擬合細胞存活曲線並計算增敏比。 論文網線上

1.5流式細胞分析將培養於50ml培養瓶中呈對數生長的HNE2細胞隨機分為：（1）單純照射組、（2）GE＋放射組、（3）PA＋放射組、（4）兩藥聯合＋放射組。單純照射組僅給予6Gy照射，其餘三組分別給予GE（0.2μg/ml）、PA（0.1μg/ml）及GE和PA的混合液作用24h後棄藥並照射6Gy。以上四組共同孵育24h，常規消化後800r/mim離心5min，棄上清，PBS清洗2遍，80%乙醇4℃固定過夜，離心去乙醇，PBS清洗2遍，用RNase（終濃度0.02mg/ml）、PI（終濃度0.1mg/ml）及0.3%的Triton?X100混合配製成的PI染液避光染色30min，流式細胞儀分析細胞週期及凋亡情況。