引言
Smac/DIABLO 蛋白（粒線體促凋亡蛋白）自被發現以來，經過幾年的研究已經成為細胞凋亡研究中的一個熱點。近年來，國內外很多學者將其應用於泌尿系統腫瘤研究和治療，並認為Smac/DIABLO及由它衍生而來的小分子多肽及其類似物將為未來泌尿系統腫瘤的治療開闢一個新領域[1]。奈米技術作為近年來出現的高技術新興科學，由於其表現出現的各種特性，有利於醫學及其各個分支的研究，特別是對腫瘤的早期診斷和治療有著顯著的意義。
本文將二者相互聯絡，通過合成的擬Smac 多肽磁性奈米粒作用於膀胱癌T24 細胞，探討其對膀胱癌T24 細胞的增殖及凋亡的影響2. 材料與方法2.1 試劑擬 Smac 合成肽羧甲基殼聚糖磁性奈米複合物（SmacN7-O-CMC-MNPS）由前期實驗製備合成。MTT 溶液、Hoechst33258 染色試劑盒購自武漢凌飛生物公司。抗Bcl-2、Bax、β-actin單株抗體購自美國cellsignal 公司。RPMI1640 培養基及胎牛血清購自美國GIBCO 公司。
其他常用生化試劑購自美國Sigma 公司。
2.2 細胞培養與實驗分組實驗
設正常對照組（A）、單純SmacN7-O-CMC-MNPS 組（B）和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁場組（C）。膀胱癌T24 細胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640 培養基培養於5%CO2的37℃培養箱中，待細胞生長至對數期時用無血清1640 洗滌2 次，每孔滴加0.5μmol/L 的SmacN7-O-CMC-MNPS，C 組磁場為8mT。轉染4h 後加入含胎牛血清的1640 培養基繼續培養。
2.3 MTT 檢測細胞增殖參照 MTT 試劑盒使用說明。
以細胞密度約104/孔接種於96 孔板，按照上述實驗分組，每組設定4 個復孔，每孔100ul，按照不同分組加入藥物，繼續培養24h、48h、72h 後採用MTT 法檢測細胞增殖活性，繪製細胞增殖率變化曲線，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖率=實驗組A490nm/正常對照組A490nm×100%，（A 為吸光度值）細胞增殖抑制率=（1-細胞增殖率）×100%。
2.4 Hoechst33258 檢測細胞凋亡將各實驗組
按照上述實驗方法處理24h 後，用0.25%胰酶+0.02%的EDTA 消化細胞，製備單細胞懸液，調整細胞濃度約為107 /ml,取細胞懸液100ul，加5ul Hoechst33258 染液（100ug/ml）細胞懸液中，充分混勻後滴於載玻片上，蓋片封片後在熒光顯微鏡下觀察細胞形態並攝影。
2.5 實時熒光定量PCR（Realtime RT-PCR）檢測
P53,Bax,Bcl-2 mRNA 的表達採用 TRIZOL 試劑兩步法提取各實驗組細胞的總RNA，運用逆轉綠試劑盒合成cDNA.使用primer5.0 設計Bax、Bcl-2、β-actin 引物。反應體系20ul：cDNA 0.8ul、上游引物0.8 ul、下游引物0.8ul、SYBR Green Mix 10ul、DEPC H2O 7.6ul.擴增條件：94℃ 預變性5min，94℃ 30S， x℃(不同基因退火溫度不同)15S, 72℃15S,共計40 個迴圈，72°延伸10min，每0.2℃讀板一次，繪製擴增曲線及溶解曲線，收集資料。
2.6 蛋白免疫印跡（Western-Blot）檢測
Bax,Bcl-2 蛋白的表達收集各實驗組細胞，用BCA 試劑盒對蛋白樣品定量。取等量蛋白20ug 上樣於10%的SDS-PAGE（聚丙烯醯胺凝膠），以120mV 恆壓電泳1h，200mA 恆流轉膜50min，膜於含5%脫脂奶粉的TBST20ml 封閉液室溫封閉30min，加一抗(1:1000)4℃過夜，次日TBST 洗膜10min×3 次，加用封閉液稀釋的HRP 標記的二抗（1：7500）室溫1h，