布氏疫苗主要包括滅活苗、減毒活疫苗、菌體組分疫苗以及現在熱門研究的基因疫苗和重組蛋白疫苗等，下面是小編蒐集整理的一篇探究布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保護效果的論文範文，歡迎閱讀參考。
布氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是布氏菌引起的能夠在人和動物中傳播的一類人獸共患病。布氏菌具有侵襲力強、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點。家畜感染後如果得不到良好的治療可引發母畜流產和不育，人感染則主要引起波浪熱和轉化為慢性感染。據調查，全球已有170多個國家和地區有布病發生和流行。而我國28個省市區的人、畜有布病存在和流行，每年造成近千萬元損失。
疫苗接種是防治布病最有效、最經濟的手段。目前，我國採用的人用布氏菌活疫苗為牛種弱毒株104M菌株，接種方式為皮上劃痕。該方法操作複雜、不能定量接種，人群接種陽轉率低，保護效果有限，被接種者因劃痕產生疼痛而不易被接受，從而影響疫苗的廣泛使用。鑑於布病疫情控制的需要，我們採用具有經濟性好和安全性高的皮內注射接種方式替代傳統的皮上劃痕。本次研究以小鼠為動物模型，採用皮內注射方式免疫，從體液免疫、細胞免疫和保護力試驗三個方面的結果全面評價疫苗的免疫原性和免疫保護效果。
1、材料與方法
1.1主要材料
1.1.1動物SPF級BALB/c小鼠，6~8周，白色雌性，共30只，由中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2009-0017，飼養於中檢院清潔級動物室。
1.1.2菌種皮下注射用布氏菌活疫苗及羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結核病疫苗室提供。
1.1.3實驗儀器Bio-II-A生物安全櫃購自西班牙Telstar公司;Dragon-MK3酶標儀購自芬蘭Labsystems公司;DH6000AB型恆溫培養箱購自天津市泰斯特儀器公司;高速離心機購自德國Eppendorf公司;酶聯斑點分析儀購於美國CTL公司;CO2培養箱購於美國Napco公司;加樣槍購於Gilson公司。
1.1.4試劑耗材牛血清白蛋白和ConA購自美國Sigma公司;小鼠IFN-γ酶聯免疫試劑盒購自美國BD公司;達優-淋巴細胞分離液、無血清培養基、IFN-γ及IL-4ELISA預包被試劑盒均購自達科為生物技術公司;鹼性磷酸酶標記羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a購自美國Bethyl公司;pNPP底物顯色液購自美國SurModics公司。
1.2方法
1.2.1動物分組及免疫將30只BALB/c小鼠隨機分成3組，每組10只，分別為低劑量組(5×107/只)，高劑量組(2×108/只)，生理鹽水對照組，3組均為後肢皮下注射，劑量為0.2ml/只。
1.2.2動物血清和脾臟淋巴細胞的製備免疫4周後，對每隻小鼠進行摘眼球取血，分離血清，–20℃儲存，用於ELISA體液免疫檢測。將每隻動物無菌取出的脾臟放在篩網上，滴加淋巴細胞分離液研磨，研磨液用巴氏管吸入到15ml離心管中，滴加200~500μl達優無血清培養基進行低速梯度離心，在25℃條件下，800×g離心30min，吸出淋巴細胞層，加入10ml無血清培養基，顛倒洗滌，室溫、250×g離心收集細胞，用於ELISPOT細胞免疫的檢測。
1.2.3體液免疫檢測
1.2.3.1抗菌體抗原總IgG抗體水平檢測用間接ELISA法檢測小鼠血清IgG的效價。以滅活布氏菌體5×108/ml的濃度包被96孔酶標板，4℃過夜;以TBS-T300μl洗板5次，用1%的BSA封閉(200μl/孔)，37℃靜置1h;每孔加入100μl的50×開始倍比稀釋的待檢血清，37℃靜置1h;按1:1000倍稀釋鹼性磷酸酶標記山羊抗小鼠IgG，洗板後100μl/孔加入，37℃靜置1h;洗板，加入100μl/孔的pNPP底物顯色液，室溫避光30min後加入100μl/孔終止液(3mol/LNaOH)終止反應;在波長為405nm處檢測吸光值A405。
1.2.3.2抗菌體抗原IgG抗體亞類檢測以滅活布氏菌體5×108/ml的濃度包被96孔酶標板，小鼠免疫4周後血清為一抗，鹼性磷酸酶標記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a為二抗，其餘操作步驟同1.2.3.1。
1.2.4細胞免疫檢測
1.2.4.1分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細胞的數目檢測小鼠免疫4周後，分離小鼠脾臟淋巴細胞，取96孔細胞培養板，每孔中加混有2.0×106個/ml濃度細胞100μl，每孔分別加入100μl布氏PPD抗原(終濃度為5μg/ml和10μg/ml)和滅活菌體抗原(終濃度為1×108/ml和1×107/ml)。每種抗原刺激物做復孔，另用細胞培養液作陰性對照，一孔加ConA作陽性對照(終濃度為5μg/ml)。共同孵育16h後，按ELISPOT操作依次加入檢測抗體等試劑，洗板，顯色，計數斑點數。
體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子產生水平檢測取48孔細胞培養板，每孔中加2.0×106個/ml濃度細胞400μl，每孔分別加入50μl布氏PPD抗原(終濃度為5μg/ml和10μg/ml)和滅活菌體抗原(終濃度為1×108/ml和1×107/ml)。分別以ConA(終濃度為5μg/ml)和培養基為陽性和陰性對照。37℃，5%CO2培養箱中孵育18h，孵育完畢對培養物進行離心，取各孔細胞培養液上清，用小鼠IFN-γ、IL-4ELISA試劑盒檢測體外不同刺激物刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ、IL-4的情況。
1.2.5布氏菌活苗保護力檢測在小鼠免疫4周後，各組取5只小鼠，對每隻小鼠皮下攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，攻擊劑量為5×108cfu/只，4周後無菌取脾臟，通過脾臟細菌計數評價布氏活苗的免疫保護作用。
1.3統計學處理
實驗資料以x±s表示，各組動物的效價取以10為底的對數後進行t檢驗;用GraphPadPrism6繪圖及SPSS統計軟體分析，結果以P<0.05表示差異有統計學意義。
2、結果
2.1小鼠血清中抗菌體抗原總IgG水平測定。
小鼠血清用間接ELISA方法測抗體水平，結果顯示，陰性組小鼠檢測不到特異性抗體，低劑量組和高劑量組小鼠均可檢測出，但低劑量組抗體水平略高於高劑量組，經統計學分析兩者差異無統計學意義(t=1.890，P=0.095>0.05，n=10)，結果見圖1。
2.2抗菌體抗原抗體亞類測定
抗體亞類分析結果顯示免疫組小鼠均產生特異性IgG1、IgG2a抗體，兩者的水平相近，結果見圖2。
2.3ELISOPT結果
將已形成斑點的96孔板終止反應，自然風乾過夜後上機計數並拍照，對每孔內的斑點進行質控。最終斑點計數顯示低劑量組和高劑量組在不同濃度的PPD和滅活菌體抗原刺激下分泌IFN-γ、IL-4的脾臟淋巴細胞數明顯多於陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見圖3、4。
2.4體外再刺激免疫小鼠脾細胞因子檢測結果
利用ELISA方法檢測以PPD抗原(5μg/ml，10μg/ml)和滅活菌體抗原(1×108/ml，1×107/ml)體外刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ、IL-4水平。結果顯示，在不同濃度PPD和滅活菌體抗原刺激下分泌的IFN-γ的含量明顯高於陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)，結果見圖5。IL-4含量很低，達不到標準曲線的檢測限，結果沒有統計學意義。
2.5布氏菌活苗免疫保護力結果
為評價布氏菌活疫苗的保護力，用羊布氏菌M5弱毒株皮下攻擊免疫動物，以脾臟布氏菌分離數為指標，評價保護力，結果見圖6。低劑量免疫組小鼠脾臟的細菌載量與陰性對照組比較有顯著性差異(t=4.406，P<0.05，n=9)，高劑量免疫組小鼠脾臟的細菌載量與陰性對照組比較有顯著性差異(t=3.842，P<0.05，n=8)。說明小鼠免疫布氏菌活苗獲得很好的免疫保護。
3、討論
機體對布氏菌的清除依賴於體液免疫和細胞免疫的'聯合作用。體液免疫產生的抗體在細胞外能夠阻斷布氏菌與宿主細胞間相互作用，並將其包裹起來抑制菌體釋放內毒素;在胞內阻止細菌在宿主細胞內的複製繁殖。本試驗以低、高劑量免疫布氏活疫苗，檢測免疫4周後血清抗體，結果顯示，低劑量組和高劑量組小鼠可檢測到高滴度特異性抗體，低、高劑量組IgG效價幾何均數分別為459、229。由此可見，產生特異性抗體滴度比較低，說明體液免疫水平相對較弱。抗體亞類分析結果顯示免疫組小鼠均產生特異性IgG1、IgG2a抗體，兩者抗體水平相近。
布氏菌是胞內寄生菌，細胞免疫對殺滅布氏菌起關鍵作用。布氏菌感染宿主後被APC提呈給吞噬細胞，同時激發APC分泌IL-12、IL-4細胞因子，引起Th0細胞(CD4+)分別分化Th1和Th2細胞。Th1細胞分泌IFN-γ啟用吞噬細胞的吞噬功能，參與細胞免疫;Th2細胞分泌IL-4細胞因子主要參與體液免疫。本研究，分別用ELISOPT和ELISA方法對不同濃度的PPD和滅活菌體抗原刺激下分泌IFN-γ和IL-4脾淋巴細胞數目和含量進行檢測。ELISOPT結果顯示，與陰性組比較，實驗組在不同濃度的兩種刺激物下分泌IFN-γ、IL-4脾淋巴細胞數目均有統計學差異;ELISA結果顯示，與陰性組比較，實驗組在不同濃度的兩種刺激物體外刺激分泌IFN-γ含量有顯著差異，IL-4含量很低。實驗結果充分說明布氏菌疫苗免疫小鼠誘導(CD4+)向Th1細胞的分化，機體主要以細胞免疫為主。
疫苗的效力測定實驗是評價疫苗免疫保護性最可靠指標。傳統對布氏疫苗的研究主要是使用豚鼠，效力實驗用強毒株攻擊，本次研究參照《中國藥典》效力測定的方法，以小鼠為動物模型，羊布氏菌M5弱毒株攻擊，大大提高了實驗的經濟性和安全性。試驗結果顯示，免疫組小鼠脾臟的細菌載量與陰性對照組比較有顯著性差異，說明小鼠皮下免疫布氏菌活疫苗獲得很好的保護效果。另外，由於小鼠皮上劃痕不易操作，無法加入傳統的劃痕疫苗對照，該比較研究將進一步以豚鼠為模型進行探索。
本次試驗是對皮下免疫效果的初步研究，試驗表明，布氏疫苗採用皮下免疫途徑是可行的，免疫後能獲得很好的免疫原性，注射用布氏活苗有希望代替皮上劃痕用疫苗，不但接種方式簡單，而且接種劑量更低，但能否真正取代傳統劃痕疫苗，還有待強毒布氏菌攻擊保護試驗和臨床試驗進一步研究