已發現的糖蛋白激素主要是由脊椎動物垂體前葉細胞合成和分泌的促黃體激素、促卵泡激素和促甲狀腺激素，以及胎盤產生的人絨毛膜促性腺激素。被稱為促性腺激素，通過調節性腺內配子發生和類固醇激素合成來促進辜丸和卵巢的功能，臨床主要用於輔助生殖(促進卵泡發育、成熟及排卵)，治療不孕不育症，調節甲狀腺的生化和生理過程，促使甲狀腺素的合成和分泌，臨床用於該激素缺乏狀況的檢查或替補性短暫維持，在甲狀腺疾病的治療中扮演重要角色，如用於分化型甲狀腺癌的診斷和隨訪，用於刺激清除殘留甲狀腺以及治療甲狀腺癌轉移灶，用於刺激治療非毒性結節性甲狀腺腫以及提高低分化甲狀腺癌化療療效等。過去，這類製品來源於垂體或尿液提取物，成分複雜。現在已實現基因重組技術生產，成份單一。重組人LH、重組人FSH、重組HCG和重組人TSH已先後被批准上市。生物效價是糖蛋白激素質量控制的重要指標，隨著對高純度重組產品理化結構與生物功能關係認識的不斷深入和積累，研究發現糖蛋白激素製品的體內生物活性高度依賴糖基化的一致性，因此，現已逐步趨向於以理化指標的檢測代替經典的生物活性測定方法。本文對影響生物效價的關鍵因素、質量控制中的關鍵指標進行梳理回顧，進而分析探討糖基化修飾控制對生物效價、批間一致性的重要性。
1生物效價的定義
糖蛋白激素生物效價量值“單位”是一個抽象的概念，通過參照標準品，根據其在生物系統(體內或體外)產生特定生物反應的強弱，確定效價即生物活性。早期沒有標準品時，通過測定其內分泌生理功能，定為動物單位，如HCG定義1個鼠單位為可從陰道塗片觀察到雌幼齡大鼠發情所注射的HCG的量，從絕經婦女尿中提取的尿促性腺激素也是相同定義。其缺餡為:沒有特異性，缺乏標準化，無法實驗室之間比較[[9]。因此世界衛生組織通過建立國際標準品，確定國際單位，對第1次或國際參考品通過組織國際間協作標定，最終達成共識而定義IU數值。現在重組糖蛋白激素除:HCG外，rhFSH，rhLH和rhTSH都已有，除rhTSH的是定義的IU外，rhFSH和rhLH的IU由提取的FSH和LH標定而來。標準品一般原則為數值上保持連續性，由上一次標準品標定下一次標準品;每一標準品有專門用途，只供生物測定用或只供免疫測定用;使用時遵循“同質”原則，如對rhFSH產品要用rDNA的標準品檢測，不能用尿源的。標準品或參考品的建立和溯源是生物效價量值測定和賦值的重要基礎，生物製品活性或效價測定正是通過生物體外或體內試驗方法並與標準品或參考品對照而得，重組糖蛋白激素生物類似藥的研發過程中，生物活性檢測被認為不僅是產品性質研究的一部分、批間分析鑑定的重要檢測項，同時也是產品結構確證的有力補充，可反映產品的作用機制，從而與臨床應用聯絡起來。
2糖基化的異質性與質量控制
糖蛋白激素家族是各由1個。啞基和1個p-亞基組成的異質二聚體，以非共價鍵結合，所有的。-ZL基都是相同的人。基長92個氨基酸，而和TSH的p啞基氨基酸殘基各不相同糖鏈與膚鏈部分以共價方式結合，通常連線在天冬酞胺上，稱為N寡糖側鏈啞基的C末端比LH延長了24個氨基酸，稱為竣端膚，其上含有4個糖鏈連線於絲氨酸殘基，稱為U寡糖側鏈。重組糖蛋白激素異質性也是由於糖基化的不均一導致存在多種異型體，同一種激素，唾液酸含量、糖鏈長度、分枝型別與末端的變化，造成糖蛋白激素分子結構的異質性，LH與FSH存在近百種異型體。寡糖側鏈具有甘露糖,酞葡萄糖胺組成的核心結構，延伸的分支末端有半乳糖、巖藻糖、唾液酸等，糖側鏈比糖側鏈更加多樣複雜化，沒有共同的核心結構唾液酸含量的變化是導致糖基化不均一的關鍵，重組糖蛋白激素的'活性是由該混合物異型體結合到靶組織而達到的效果。指導原則(生物技術產品和生物製品的檢驗方法和可接受標準)對重組糖蛋白的異質性，指出“這些異型體可能有活性，不會對產品的安全性和有效性產生不利影響，如已證明每批產品的異型體是一致的，就不必對每一種形式的活性、安全性和有效性進行評價，這些異型體決定了它們的質量，對異質體可當作相關物質加以鑑定，確保批與批間一致性”。由此可見批間一致性是質量評價的關鍵。為保證批次間亞型分佈的一致性，對相關物質和雜質(降解或聚合物)需進行必要的分析。如以反相高效液相色譜對重組糖蛋白激素進行膚圖分析;採用RP}IPLC檢測。和}-ZL基氧化產物;通過十二烷基硫酸鈉嗜食丙烯酞胺凝膠和排阻高效液相色譜法檢測遊離亞基與多聚體含量;等電點聚焦電泳技術鑑別亞基分佈，檢測主色帶和等電點範圍等，並與內部對照品比較，對所有色帶的物質進行控制。總之，控制產品相關雜質與物質的種類和含量是該類產品質量評價的重要內容，是保證批間一致性的前提。
3糖譜分析及值與效價關係
大量實驗證實N寡糖側鏈上唾液酸與糖蛋白激素的等電點、代謝清除率和生物活性密切相關，唾液酸含量越高，pI越低，生物活性越高，pI與體內生物活性間具有高度相關性(r=0.95}P<0. 01)，以化學或酶製劑去糖基化後，皆喪失激素活性,LH和HCG去除唾液酸後，雖仍能與受體結合，具有體外活性，但卻無體內活性，因已被從體內快速清除。高唾液酸結構，降低了糖蛋白激素的pI，低pI的糖蛋白在體內與肝網狀內皮細胞表面特異性蛋白受體結合力降低，導致消除率降低，體內半衰期延長，如pI=4.27的rFSH比pI =5. 49的半衰期長1倍，而以神經氨酸酶去唾液酸後，HCG的半衰期從50 min降至1 min。質量標準的研究正是基於它們的物理化學性質及對效價的影響因素，關鍵是N梅氰糖側鏈上唾液酸含量，因0-寡糖側鏈分子上唾液酸化水平與生物活性的相關性小圈，因此N寡糖側鏈的糖基化分析和唾液酸含量是保證重組糖蛋白激素具有生物效價的關鍵，糖譜分析是質量評價的重要內容，通過與對照品比對糖譜，及Z值計算，確保批間一致性。Z值是一假設引數，按不同種唾液酸比例評價唾液酸化程度，採用陰離子交換高效液相色譜和熒光檢測儀分析糖譜，半定量分析相同唾液酸數量的寡糖百分比，即按糖鏈多聚糖所帶電荷數，洗脫分離唾液酸化組分為中性唾液酸化組分及單、二、三、四、五唾液酸化組分，各自組分糖所佔色譜峰面積除以所有組分糖總面積的百分比(A)乘以其相應電荷之和為Z值。由於糖側鏈上唾液酸無生物活性，故Z值只需計算N寡糖鏈多聚糖，可通過一種高特異性酶膚N糖昔酶F，選擇性在蛋白質N連結位點將完整的N}糖鏈作為葡萄糖胺類完整裂解下來，酶解消化釋放出完整的N寡糖側鏈聚糖。Z值具有高度的準確性(回收率91%一108 %)和精密度( RSD < 2% )，是特徵引數，代表N寡糖側鏈上唾液酸化水平，能檢測出不同生物活性的批次間糖基化的差異，效價低的Z值小，僅攜帶甘露糖無唾液酸的糖基化結構(Z = 0 ); rhLH和rHCG的Z平均值分別184,15。和150 }zo7，每一產品有其固定Z值範圍，故糖蛋白激素質量標準中Z值不可缺少，如某公司生產的rhFSH產品3年內生產的120批Z值在177-200，表現出高度批次間一致性。因此糖譜和Z值成為評價糖基化水平和重組糖蛋白激素質量、保證其具有生物活性和批間一致性的重要指標。
4含量測定與效價關係
根據ICHQ6B規定:當藥物的物理化學資訊(包括高階結構)可以通過理化方法確定，並能證明與生物活性有相關性，以及存在完整的歷史生產檔案，含量與生物效價間形成穩定的轉化值時，就可以用準確、精密的理化方法測定含量(林g或mg)代替生物效價。是測定重組促性腺激素蛋白含量的常用方法，精密度高;對rhTSH則以ELISA法測定含量。生物效價與含量之比為比活性，rhFSH ，rhLH ，rHCG比活性分別為>10 000 9 000，大大高於提取產品，並且糖型結構也要簡單的多。與受體結合後產生的生理效應是重組糖蛋白激素所有異型體的綜合效應與製劑的量相關，受體結合反應依賴產品的準確劑量，而產品亞型分佈、糖基化的一致性是前提。當經過長期考察批次間高度一致的產品，符合要求時，如某公司的rhFSH產品，7年內多批rhFSH原液，批與批次間高度一致，比活性穩定，呈常態分佈，效價與蛋白含量間存在固定關係，故以含量標識回，取代在常規生產檢定中誤差大(RSD 20% )，耗費人力、物力，傷害動物的體內生物檢定方法，以理化分析的方法代替，用於成品的質量控制。研發重組糖蛋白激素生物類似藥企業，可積累資料，在確保批間一致性、工藝穩定條件下，使含量測定成為常規生產中的質量控制方法，而取代生物測定。
5展望
重組糖蛋白激素現階段表達於CHO細胞，已實現大規模生產，細胞培養條件高度自動化、可控性強，純化工藝穩定，製品純度和比活性高，如rhFSH純度可達到>99 %，純度和比活性高(>99%)，未見免疫原性問題報道。通過生產過程的嚴格監控保證質量的穩定與批次間的高度一致性。
基於糖蛋白激素的構效關係，實現在CHO細胞的共表達，由此製備的長效rhFSH，商品名:已被批准上市;另有將FSH與免疫球蛋白的恆定區片段(Fc)融合，製備融合蛋白，得到長效rhFSH的報道。通過對它們的質量研究與評價，不斷完善與生物效價相關的關鍵指標，來確保產品的一致性。