前言
在皮革染色過程中，所用染料並不能被皮革完全吸收，一部分染料隨廢水排放而造成汙染。廢水中殘存的染料即使濃度很低，排入水體也會造成水體透光率和氣體溶解度降低，導致生態系統的破壞。皮革生產中所用染料種類多、結構複雜，又多屬於難降解物質。同時，人工合成的染料通常含有複雜的芳香環結構，化學穩定性高，還具有一定程度的生物毒性，尤其是部分染料的降解中間體的毒性強，其排放嚴重汙染環境。近年來隨著對高濃度染料廢水處理研究的增多，出現瞭如光催化、吸附等新型物化處理材料，但對染料的物化法處理執行成本通常較高，且容易產生二次汙染。
微生物具有繁殖速度快、適應性強等特點，利用高效脫色微生物進行環境汙染整治不僅成本低，且可減少二次汙染的產生，因此，製革廠對含染料廢水的處理依然以生物處理方法為主。研究皮革染料的生物降解性對於評估其在生態環境中的滯留情況以及指導染料的選用具有重要的現實意義，而且可以為選擇合理的染料生物處理方案提供理論依據。染料的種類繁多，按照其髮色基團的不同可將其分為偶氮染料、三苯基甲烷類染料和蒽醌型染料等。其中偶氮染料是目前製革生產中使用最廣、用量最大的染料，佔染料總用量的70%。本文以偶氮染料、三苯基甲烷類染料和蒽醌染料的生物降解機理和脫色酶等為基礎，綜述了皮革相關染料的生物降解研究進展，以期為皮革染料生物降解的深入研究乃至工程應用提供借鑑作用。
1染料降解菌及脫色路徑研究進展
1．1偶氮染料降解菌及脫色路徑
1．1．1偶氮染料的降解菌研究進展
偶氮染料是製革生產過程中使用量最大的一類染料，約佔全部染料的70%左右。偶氮染料的髮色基是偶氮雙鍵，助色基是氨基、羥基、甲基和磺酸基等。自20世紀70年代末發現某些可以降解偶氮染料的腸道細菌以來，染料的生物脫色和降解研究越來越受到學者們的重視，目前已分離出對偶氮染料具有脫色效應的菌株主要包括芽孢桿菌、黃單胞菌、克雷伯氏菌等十幾個菌屬。已發現的偶氮脫色菌大多數是在厭氧條件下非特性還原偶氮鍵，從而使染料產生脫色。OAn-janeya等人［1］從染料汙染土壤中提取出了2種在酸性間胺黃的生物脫色過程中，均具有一定作用的菌種，分別為Bacillussp．AK1和Lysinibacillussp．AK2。許玫英等人［2］從印染廢水活性汙泥中分離得到一株脫色希瓦氏菌(Shewanelladecolorationis)S12，具有高效的染料脫色活性，該菌株在偶氮染料濃度為50mg/L的培養基中培養4h後，對染料的去除率達到96%。好氧條件下對偶氮染料具有還原脫色能力的菌株近年來也被陸續發現，但這些菌株多較難以偶氮染料作為唯一碳源和能源進行好氧生長。E．Franciscon等人［3］則將一株兼氣性克雷伯氏菌用於微好氧/好氧降解偶氮染料的工程應用。研究也發現了少量能以偶氮染料為唯一碳源和能源進行好氧生長的菌株，Kul．la等人［4－5］從菌群中分離出XenophilusazovoransKF46F和PigmentiphagakullaeK24，它們可分別以偶氮染料羧基橙Ⅰ和Ⅱ為底物進行生長。Coughlin等人［6］研究證明了Sphingomonas1CX對幾種磺化偶氮染料和低濃度的酸性橙7具有降解能力。然而，目前研究的好氧生物降解偶氮染料多是在搖床好氧條件下以較大接種量培養，因此這類好氧偶氮染料脫色效應，實質可能是通過好氧菌對培養基中氧氣的大量消耗，造成區域性厭氧條件，從而促進偶氮雙鍵的酶促還原，其偶氮還原的實質仍然是厭氧還原。
1．1．2偶氮染料脫色路徑研究進展
在偶氮雙鍵斷裂的過程中，參與催化的酶通常統稱為偶氮還原酶。對於偶氮類化合物在偶氮還原酶催化下的降解機理，到目前為止研究得並不十分清晰。過去認為偶氮染料還原生成芳香胺是一步反應，然而隨著研究的深入，有人指出在這一過程中有可能存在一個反應中間體。Chang等人［7］在偶氮染料Red22脫色研究中，認為這個過程中可能有不完全還原中間體的存在。Nakanishi等人［8］則在偶氮還原酶酶促動力學研究中發現，在酶促脫色反應中染料和NADH作為雙底物符合乒乓原理。通過計量學計算，推匯出還原過程可能存在加氫偶氮苯的中間體。嚴濱等人［9］則以甲基紅為底物，運用紫外光譜、液相色譜與質譜研究了偶氮染料的降解過程，驗證了在偶氮染料還原過程中加氫中間體的存在，提出甲基紅偶氮雙鍵的還原機理，如圖1所示。在厭氧條件下細菌的偶氮還原反應，是在非特異性還原酶作用下的電子傳遞過程。偶氮染料作為末端電子受體，接受從還原中間體傳遞來的電子而被還原，細菌可能在這一過程中獲得生長所需的能量。
1．2三苯基甲烷染料降解菌及脫色路徑研究進展
三苯基甲烷染料結構為一個碳原子連有3個苯環，不同染料的苯環上還帶有不同的側鏈基團。Nelson等人［10］在關於三苯基甲烷染料龍膽紫和結晶紫的生物毒性研究中發現:2種染料對中國大頰鼠類的CHO細胞和其它5種哺乳動物細胞的有絲分裂具有生物毒性。三苯基甲烷染料對生物細胞的致癌性和致突變性也被大量研究所證明，而能夠對三苯基甲烷類染料進行初級脫色的微生物種類則多種多樣，細菌、放線真菌以及藻類中不同的屬種均發現有脫色菌株。20世紀80年代，Yatome等人［11］分離出能對甲基紫和結晶紫具有脫色能力的Psendomonaspseudomallei13NA，經檢測其屬於假單胞菌屬菌株，同時採用TLC技術對甲基紫和結晶紫的降解產物進行分離，發現了某些未知產物。Yatome等人［12－13］在後期的研究中，利用TLC和GC－MS技術發現了結晶紫在枯草桿菌B．subtilisIF013719和放線菌N．corallina降解作用下的主要代謝產物均為4，4’－bisdimenthylaminobenzophenone和α－dimethylaminophenol。Chin－HungChen等人［14］在Shewanellasp．NTOU1厭氧降解結晶紫的研究中，同樣檢測出了上述2種產物。這說明細菌降解三苯基甲烷類染料過程的初步降解機理可能是相同的，見圖2。
而對於三苯基甲烷類染料具有脫色效應的真菌，其脫色降解酶屬於非特異性降解酶系，因此具有脫色效應的真菌多對三苯基甲烷類染料具有廣泛脫色降解作用。而真菌中木質酶系對三苯基甲烷類染料的脫色，則主要是通過去甲基化過程實現的。1．3蒽醌染料降解菌及降解路徑研究進展含有蒽醌結構或多環酮結構的染料稱為蒽醌染料，染色具有色澤鮮豔、固色率高、染色牢度好等眾多優點，但因為這種多芳環結構的高化學穩定性，使其更難降解。儘管蒽醌類染料的使用量僅次於偶氮染料，但目前關於蒽醌染料生物降解的脫色菌和脫色機理報道很少。
目前，如Bacillussubtilis、Pichiaanomala和Coriolusversucilor等部分微生物已被證明對蒽醌染料具有降解作用，並對蒽醌染料的降解路徑進行了初步研究。許玫英等人［2］對脫色希瓦氏菌S12蒽醌染料脫色的研究結果表明:該菌株先與染料形成絮凝物，使水體中染料濃度迅速下降，再通過生物降解逐步實現染料的開環降解，該菌株的脫色關建酶屬於組成型表達。SaadiaAndleeb等人［15］則利用高效液相色譜，對蒽醌染料的真菌降解產物進行了測定。而細菌生物降解蒽醌染料時，通常認為初始階段通過未知還原酶的催化作用下還原裂解其共軛鍵，從而改變其結構。同時染料的脫色還原速率與其醌環取代基性質有很大關係，取代基的供電性越大，其脫色速率越快。王曉春等人［16］對4種蒽醌酸性染料的細菌脫色能力研究，驗證了弱酸豔綠5G的脫色降解主要靠胞內酶的酶促作用。
2染料生物降解的脫色酶研究進展
2．1偶氮還原酶研究進展
厭氧條件下進行的偶氮還原反應過程的底物的專一性很低，多種還原性中間介質均能還原偶氮化合物。早期研究認為，細菌經由還原酶催化產生的黃素對偶氮染料進行非特性的還原斷鍵，同時由於強極性的染料難以穿透細胞膜，因此細胞提取物對偶氮化合物的厭氧還原速率通常比完整細胞更快，這種機理模型認為黃素還原酶即是文獻上泛指的偶氮還原酶。而另一種機理模型則認為細菌厭氧還原偶氮染料這一過程，並不需要偶氮染料或是還原黃素傳遞穿過細胞膜。Keck等人［17］在Sphingomonasxenopha-gaBN6的偶氮染料脫色機理研究中則發現，細胞中存在2套偶氮還原酶系統，一套是位於細胞質中的黃素氧化還原酶，還有一套是蒽醌類化合物(2，6－雙磺酸蒽醌)，其在偶氮染料非特異性還原過程中，起到一種氧化還原介質的功能，該物質通過細胞膜上的蒽醌還原酶還原生成羥基蒽醌，從而還原基質中的偶氮染料。泛醌氧化還原酶AQS能顯著提高細菌的厭氧偶氮還原率，但對細胞提取物影響不大，此反應機理如圖3所示。
發現從腸道分離出的嚴格厭氧偶氮脫色菌的偶氮還原過程，不需要穿過細胞膜。NAM等人［19］則發現NADH在無偶氮還原酶存在的情況下，也可自身通過四電子方式將幾種偶氮染料還原為相應的芳香胺。Run等人［20］從大腸桿菌中分離出一種NADH依賴性的lawsone還原酶，分析表明:lawsone還原酶就是氧不敏感的硝酸還原酶NfsB，在基質中新增lawsone能顯著提高不同磺化偶氮染料的還原脫色效率。Maier等人［21］報道從芽孢桿菌SF中可提取出一種具有耐鹼、耐熱性的偶氮還原酶，屬於NADH依賴性還原酶，厭氧條件下新增黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(FAD)，可有效促進酶的脫色活性。許玫英等人［2］則對脫色希瓦氏菌S12的脫色酶位置進行測定，研究發現:S12T脫色酶屬於組成型表達的胞內酶，不需要通過與底物接觸而誘導產生。該酶位於細胞膜內，對分子氧本身並不敏感，但須在厭氧條件下才顯示出脫色活性。細胞膜上脫色酶的脫色活性與FAD的量成正相關，加入NADH可進一步增強FAD對脫色酶活性的促進作用。
另外，近幾年研究也發現了幾種好氧偶氮還原酶，通過對其純化、特徵分析得到了它們的基因序列，對其序列分析表明，好氧偶氮還原酶之間不具有明顯的同源性。表明，這幾種蛋白質是按不同進化方式成為具有偶氮還原活性的酶，而好氧條件下偶氮鍵的代謝不能限制偶氮複合物的`降解。對於好氧條件下的偶氮生物還原，基本認為是由特異性酶催化完成的。儘管在有氧條件下，一種好氧的偶氮還原酶能降解幾種偶氮染料，但每一種酶對染料催化脫色具有不同的特異性。例如，從Xenophi-lusazovoransKF46F和PigmentiphagakullaeK24分別分離純化得到的羧基橙Ⅰ偶氮還原酶和羧基橙Ⅱ偶氮還原酶，都是單體非黃素依賴性還原酶，並且NADPH是其最適輔助因子，但羧基橙Ⅰ還原偶氮酶要求偶氮鍵的β位上為羧基，而羧基橙Ⅱ偶氮還原酶則嚴格要求在偶氮鍵的α位上為羧基基團［4－5］。
2．2木質酶系脫色酶的研究進展
由於真菌脫色降解酶屬於非特異性降解酶系，真菌多表現為對多種染料具有脫色效應，對染料具有廣譜性降解作用。例如，黃孢原毛平革菌，其降解酶屬於木質素降解體系。其降解過程中的關鍵氧化酶主要為LiP和MnP。對於大部分染料，LiP的降解機理主要為直接氧化導致C—C鍵斷裂、芳香環開環、羧基化、苄基醇化、去甲基化、羥基化和二聚化等。LiP對染料的催化降解機理如圖4所示。研究表明:LiP以VA為中間電子遞體，VA是LiP酶合成誘導物，新增一定量VA可較大促進染料的脫色效應。MnP的降解機理與LiP類似，也產生2種酶的中間體MnPⅠ和MnPⅡ，而MnP以Mn2+為中間電子遞體［22］。Bonnarnle等人［23］研究表明:Mn2+對MnP合成起調節作用，基質中不新增Mn2+，MnP幾乎不合成，而Mn2+濃度在0～40mg/L間時，濃度越高越利於MnP的合成。由於這2種過氧化物酶只提供電子的轉移而不是直接與化合物結合，從而使該類菌具有廣泛的脫色降解作用，而且不易受化合汙染物的毒性影響。研究證明:木質酶系中的漆酶也對染料具有廣泛的脫色作用，其為一種以O2為電子受體的含銅蛋白質，能經4次單電子傳遞催化多酚化合物，形成醌和自由基，再以鏈式反應傳遞自由基以氧化底物，從而使染料脫色［22］。同時研究還證明，在基質中新增一定的小分子氧化還原介體，有助於漆酶的催化脫色作用［24］。
2．3脫色還原酶TMR的研究進展
Moon－SunJang等人［25］從對三苯基甲烷類染料具有脫色效應的Citrobactersp．strainKCTC18061P中分離純化出還原酶TMR，經分析該酶由2個31kDa分子質量的亞基組成的同型二聚體。還原酶TMR為NAD(P)H依賴型還原酶且具有底物特異性，並在60℃和pH值9．0條件下酶催化活性最大。根據紫外－可見光譜分析和薄層色譜法測定，TMR是通過去甲基化反應催化三苯基甲烷類染料脫色，因此對於無烷基側鏈的三苯基甲烷類染料不具有催化活性。對還原酶的氨基酸序列進行分析發現，該酶的N端序列與NAD(P)H依賴型酶具有很高的同源性，即包含有核苷酸結合基序“GXXGXXG”。同時研究還發現，將序列中的3個甘氨酸分別用丙氨酸替代，酶促脫色效率均有不同程度的降低，說明這3個甘氨酸在酶與底物和輔酶的結合上均具有不同作用，並都與酶活相關。
2．4其它脫色酶的研究進展
除上述脫色酶外，SeongJunKim等人［26］研究還發現了一種糖蛋白的過氧化酶(DyP)，其對21種不同型別染料中的9種染料(主要為蒽醌類顏料)具有脫色效應，同時2，6－二甲氧基和愈創木酚可作為DyP合成的誘導物。另外，從小鼠肝臟微粒體中提取的細胞色素P450單氧加氫酶，對染料也具有脫色作用，其催化過程可被CO和甲吡酮所抑制。研究發現:甲吡酮能抑制部分真菌對三苯甲基類染料的脫色效應［27］，因此，細胞色素P450單氧加氫酶也可能參與了真菌的脫色作用。任隨周等人［28］從嗜水性單胞菌DN322中分離純化出一種對三苯基甲烷類染料具有高效脫色效應的NAD(P)H依賴型氧化酶，命名為TpmD，研究發現，甲吡酮及維生素C(VC)對該酶活性具有明顯抑制作用。張培培等人［29］對有機溶劑和抑制劑對TpmD酶活的影響進行了進一步研究，結果表明:乙醇、丙酮和SDS均會使TpmD的酶活迅速喪失，而低濃度(＜10%)的二甲基亞碸則有利於重組酶活性的維持，同時研究還發現二硫蘇糖醇(DDT)可取代NADH作為TpmD的輔酶，並且催化脫色效率有明顯提高，而脫色產物的全譜掃描分析表明，DDT輔助TpmD酶促脫色機理與NADH作為輔酶的機理表觀是完全不同的，氧化酶TpmD的脫色機理有待進一步研究。
3皮革染料生物降解性研究展望
隨著綠色化學的理念成功引入皮革化學品的分子設計中，近幾年對於各類皮革化學品結構與生物降解性相關性的研究開始增加。染料作為製革廢水中主要難降解有機汙染物之一，對其生物降解效能的研究也是重點工作之一。張文軍等人［30］對5種皮革常用染料的好氧生物降解效能進行了研究，結果表明:好氧條件下活性汙泥對5種染料的脫色效應較低，主要依賴菌膠體的吸附作用。染料及其降解中間體多不能被生物好氧降解，但在厭氧條件下卻能被降解或部分降解，並改變其分子結構，使其成為易於好氧生物降解的有機物。因此，對於皮革染料而言，應主要集中於厭氧條件下的生物降解效能研究，探索染料結構與厭氧降解效應的一般關係。
同時，染料生物降解效率較低，一方面是因為微生物較難以其為唯一碳源進行生長，另一方面則因為單基質中缺乏脫色酶的誘導物，因此，基質的組分對染料生物降解的影響較大。皮革行業應側重於基質對染料生物降解的影響效應研究，並結合自身工業廢水特點，尋找有利於染色廢水脫色的共基質降解物質。例如，製革生產過程中，復鞣染色加脂工序通常是同浴進行，而加脂劑作為易降解物質，可為染料降解菌的生長提供有效的碳源和能源，同時，加脂劑的降解過程可快速消耗水體中的溶解氧，從而形成厭氧的微環境促進染料的厭氧脫色。另外，乳化成分則可促進水體底部的氣質傳遞，本課題組前期試驗研究已證明:氧化－亞硫酸化牛蹄油在靜置培養下，對酸性品紅和酸性大紅的生物脫色具有明顯效用，其促進機理仍需進一步研究。復鞣工序中常用的植物鞣劑和苯磺酸類合成鞣製，其生物降解過程中所產生的部分中間體，可誘導真菌過氧化酶的產生，從而具有提高製革染色廢水生物脫色效率的可能性。